厭氧微生物培養裝置實驗教學改革與實踐

蔣海明， 王路路， 李 俠， 張 鵬， 沙浩男， 劉振旺， 李雅麗

(內蒙古科技大學 a. 生命科學與技術學院；b. 礦業研究院，內蒙古 包頭 014010)

0 引 言

厭氧微生物在自然界分布廣泛，種類繁多，作用也日益引起重視。厭氧微生物培養的關鍵是要使該類微生物培養時處于無氧的環境中。目前，厭氧微生物培養一般采用厭氧管[1-3]、厭氧瓶[4-8]、厭氧罐培養法[9-10]及厭氧手套箱[11-13]。厭氧管體積較小(≤30 mL)，一般只適合少量微生物培養(≤10 mL)。厭氧罐與厭氧培養箱雖可用于厭氧微生物培養，但也存在許多不足，如價格昂貴、體積較大、不能恒溫及不適合極端厭氧微生物(如海底菌種、深層土壤菌種)培養，且一般本科實驗室配置較少或不配置，因而無法滿足本科厭氧微生物實驗教學需求。在實驗室，厭氧瓶的應用較廣泛。厭氧瓶體積可變(50～1 000 mL)，既可適用少量厭氧微生物的培養，也可適用大量厭氧微生物培養。實驗室使用的厭氧瓶分進口和國產兩種，進口厭氧瓶耐高溫、高壓且不易爆炸，但價格昂貴，不宜在本科實驗教學中大量使用。國產厭氧瓶雖然價格較低，但高溫下耐高壓性能差、易爆炸，厭氧瓶的爆炸除對滅菌設備造成損壞外，更危及實驗人員的生命安全。此外，常規厭氧瓶在使用過程中，瓶口最容易造成損壞，一旦厭氧瓶的瓶口損壞，則整個厭氧瓶無法再使用，需購置新的厭氧瓶，而購置新的厭氧瓶成本又高。張祥勝等[14]設計了一個簡易厭氧生物反應器，但是該裝置不能實現純厭氧微生物的培養、厭氧微生物的分離與純化，因為其裝置無法實現曝氣脫氧。此外，該裝置成本較高。因此，如何設計一種耐高溫、高壓、不易爆炸、價格低且使用壽命長的厭氧微生物培養、分離及篩選裝置，對厭氧微生物培養、厭氧微生物的實驗教學及研究都具有重要意義。

針對現有實驗室厭氧微生物培養裝置存在的問題，本研究設計及制備了一種模塊化多功能厭氧微生物培養裝置，該裝置具有結構簡單、體積可變、成本低及使用壽命長等優點，可用于二氧化碳、氮氣及H2/CO2等氣氛厭氧微生物的培養。本裝置為我校微生物學、環境微生物技術及發酵工程的實驗教學創造了良好的實驗平臺并取得了很好的教學效果。

1 厭氧微生物培養裝置的設計、制備及性能檢測

1.1 厭氧微生物培養裝置的設計

根據厭氧微生物培養的要求和特點，設計了模塊化厭氧微生物培養裝置，其結構示意圖如圖1所示，主要包括頂端開孔的蓋子、T型丁基橡膠塞、喇叭形螺紋口玻璃管(或喇叭形鉗口玻璃管)、開孔GL45耐高溫(140～180 °C)玻璃瓶蓋、316L不銹鋼墊片、開孔T型硅橡膠塞子及高硼硅螺紋口玻璃瓶。高硼硅螺紋口玻璃瓶壁厚耐高溫、高壓，可以避免密封滅菌時爆炸，克服了國產厭氧瓶高溫不耐壓的缺陷，同時其廣口有利于裝、卸料。將厭氧管的底端改為喇叭口形，既可固定螺紋口玻璃管，又能在高壓滅菌時將開孔T型硅橡膠塞子緊緊擠壓在高硼硅螺紋口玻璃瓶瓶口內壁，從而起到密封的作用。此外，喇叭形螺紋口玻璃管可更換，且價格較低，可以避免常規厭氧瓶因瓶口損壞而導致整個厭氧瓶無法再使用，需購置新的厭氧瓶的不足。316L不銹鋼墊片的使用避免了GL45耐高溫開孔玻璃瓶蓋與開孔T型硅橡膠塞子之間的摩擦，既保護了開孔T型硅橡膠塞子，又使開孔T型硅橡膠塞子與高硼硅螺紋口玻璃瓶之間密封更好。

1-高硼硅螺紋口玻璃瓶；2-喇叭形螺紋口玻璃管；3-開孔T型硅橡膠塞；4- 316L不銹鋼墊片；5- 開孔GL45耐高溫(140～180 °C)玻璃瓶蓋；6-T型丁基橡膠塞；7-頂端開孔蓋

圖1 厭氧微生物培養裝置剖面結構示意圖

1.2 厭氧微生物培養裝置的加工與組裝

1.2.1厭氧微生物培養裝置的加工

按照厭氧微生物培養裝置的設計加工及購買相關的組件：喇叭形螺紋口玻璃管(壁厚2 mm，由φ18 mm×150 mm螺紋口厭氧管改裝而成)[見圖2(a)]或喇叭形鉗口玻璃管(壁厚2 mm，由φ20 mm×150 mm鉗口厭氧管改裝而成)[見圖2(b)]、高硼硅螺紋口玻璃瓶(250 mL)(由250 mL螺紋口試劑瓶改裝而成)[見圖2(c)]、開孔T型硅橡膠塞[見圖2(d)](設計模具，加工制備)、316L不銹鋼墊片[見圖2(e)]、GL45開孔耐高溫螺口玻璃瓶蓋(由GL45耐高溫螺口玻璃瓶蓋中間鉆孔而成)[見圖2(f)]及厭氧管蓋子與T型丁基橡膠塞。為使裝置的密封性好，開孔T型硅橡膠塞的內孔直徑需比喇叭形螺紋口玻璃管外徑小1 mm，且喇叭形螺紋口玻璃管的喇叭口外徑比玻璃管外徑大6 mm。開孔GL45耐高溫螺口玻璃瓶蓋開孔直徑一般比喇叭形螺紋口玻璃管外徑大4 mm，但要小于30 mm。316L不銹鋼墊片內孔直徑一般比喇叭形螺紋口玻璃管外徑大2～4 mm，但要小于30 mm，且比開孔GL45耐高溫螺口玻璃瓶蓋開孔直徑小。表1為250 mL帶刻度厭氧微生物培養裝置的成本構成。由表1可知，每個厭氧微生物培養裝置的成本為22元，而市場上國產250 mL厭氧瓶的價格為16～36元/個，進口Thermo Fisher Scientific品牌200 mL厭氧瓶的價格為220元/個、250 mL厭氧瓶(帶刻度)為1100元/個。本研究設計、加工的厭氧培養裝置價格位于國產厭氧瓶價格范圍內，但約為進口厭氧瓶價格的1/50～1/10。

(a)喇叭形螺紋口玻璃管(b)喇叭形鉗口玻璃管(c)高硼硅螺紋口玻璃瓶

(d)開孔T型硅橡膠塞子(e)316L不銹鋼墊片(f)GL45開孔耐高溫瓶蓋

圖2 厭氧微生物培養裝置各主要組件的尺寸及剖面結構示意圖(mm)

1.2.2厭氧微生物培養裝置的組裝

按照圖1所示的結構組裝厭氧培養裝置：

(1) 將喇叭形螺紋口玻璃管穿過開孔T型硅橡膠塞至喇叭口端與T型硅橡膠塞的小端緊密接觸[見圖3(a)]；

(2) 將固定有喇叭形螺紋口玻璃管的T型硅橡膠塞塞進高硼硅螺紋口玻璃瓶，使T型硅橡膠塞的大端與高硼硅螺紋口玻璃瓶瓶口緊密接觸[見圖3(b)]；

(3) 將喇叭形螺紋口玻璃管的螺紋口端用T型丁基橡膠塞塞緊，并擰上配套的開孔蓋[見圖3(c)]；

(4) 將316L不銹鋼墊片穿過喇叭形螺紋口玻璃管的螺紋口端至T型硅橡膠塞的表面，然后利用GL45耐高溫玻璃瓶瓶蓋將316L不銹鋼墊片及開孔T型硅橡膠塞緊緊固定在高硼硅螺紋口玻璃瓶上，以完成整個裝置的組裝[見圖3(d)]。

1.3 厭氧微生物培養裝置氣密性檢測

以氮氣為檢測氣，對安裝好的厭氧微生物培養裝置的氣密性進行檢測。將裝置連接到N2氣路上，打開閥門，通過注射器針頭充入N2，然后依次將肥皂水滴加到厭氧微生物培養裝置的所有連接處，以對各個連接處的氣密性進行檢查。如果滴加肥皂水的連接處冒泡，則說明該連接處有泄漏，否則說明該連接處密封好。各連接處氣密性的檢測結果表明該厭氧微生物培養裝置的氣密性非常好。

(a)(b)(c)(d)

圖3 厭氧微生物培養裝置安裝過程示意圖

1.4 厭氧微生物培養裝置安全性檢測

制備好的厭氧微生物培養裝置(250 mL)加入100 mL去離子水，密封后置于滅菌鍋中121 °C滅菌30 min以檢驗厭氧微生物培養裝置的安全性。實驗結果表明在該條件下反復滅菌10次(3個厭氧微生物培養裝置)，沒有1個厭氧微生物培養裝置發生破損，說明制備的厭氧微生物培養裝置安全可靠。

2 厭氧微生物培養裝置實踐

利用自制實驗室厭氧微生物培養裝置培養GeobactersulfurreducensPCA(ATCC 51573)及Geobactergrbiciae(ATCC BAA-46)與Methanosarcinabarkeri800(ATCC 43569，DSM 800)的co-culture，以檢驗該裝置的有效性。

2.1 Geobacter sulfurreducens PCA的培養

GeobactersulfurreducensPCA的培養參考Tremblay等[15]的方法。采用Ferric citrate(III)(FC)培養基培養GeobactersulfurreducensPCA。檸檬酸鐵溶液(40 mmol/L)的配制參考Tremblay等[15]的方法。250 mL厭氧微生物培養裝置中加入95 mL FC培養基，插入曝氣針后塞上丁基橡膠塞，N2/CO2(80/20，V/V)曝氣45 min后密封，121 °C滅菌30 min后冷卻到室溫待用。用2.5 mL注射器向厭氧微生物培養裝置中加入1.0 mL微量微生素溶液(N2脫氧)及1 mL乙酸鈉溶液(2 mol/L)(N2脫氧)，厭氧環境接種5 mLGeobactersulfurreducensPCA(5%接種量，V/V)后置于30 °C下培養。圖4為使用本研究設計的厭氧微生物培養裝置培養GeobactersulfurreducensPCA情況。圖4(a)為未接種G.sulfurreducensPCA的FC培養基，圖4(b)為接種G.sulfurreducensPCA并培養12 d后的FC培養基。從圖4中能夠看出未接種G.sulfurreducensPCA的FC培養基顏色沒有發生變化，而接種G.sulfurreducensPCA并培養12 d后的FC培養基顏色明顯變淡且溶液濁度增加，菌種生長良好，這表明該厭氧微生物培養裝置滿足G.sulfurreducensPCA的生長要求。

(a)未接種G. sulfurreducens PCA(b)接種G. sulfurreducens PCA

圖4 未接種與接種G.sulfurreducensPCA FC培養基顏色變化

2.2 G. grbiciae與M. barkeri co-culture的培養

G.grbiciae與M.barkerico-culture的培養參考Rotaru等[16]的方法。將NBM(Media NB modified)培養基置于三角瓶中，用鋁箔紙密封后煮沸，然后將煮沸的培養基置于冰域中，利用厭氧微生物培養基制備裝置氣路通入N2/CO2(V/V=80∶20)混合氣使其冷卻至室溫。250 mL厭氧微生物培養裝置用N2/CO2(V/V=80∶20)混合氣脫氧10 min，然后用移液器量取90 mL NBM培養基至厭氧瓶中，厭氧瓶插入曝氣針后塞上丁基橡膠塞，N2/CO2(80/20，V/V)曝氣45 min后鋁蓋密封，121 °C滅菌30 min后冷卻到室溫待用。制備好的培養基厭氧環境用2.5 mL注射器加入1.0 mL微量微生素溶液(N2脫氧)、1 mL還原劑(100 mmol/L L-Cysteine 和 50 mmol/L的Na2S混合溶液)(N2脫氧)、4 mL納米四氧化三鐵液體(10 mmol/L)(N2脫氧)及1 mL乙醇溶液(2 mol/L)(N2脫氧)，厭氧環境接種M.barkeri與G.grbiciae構成的混合微生物(10%接種量，V/V)后置于37 °C下培養。利用氣相色譜定期檢測厭氧瓶中甲烷的濃度[15]。厭氧瓶中甲烷的量隨時間變化如圖5所示，接種培養72 d后厭氧瓶中甲烷的量達(2.09±0.58) mmol (±SD，n=3)，這說明使用自制的厭氧微生物培養裝置成功地培養了G.grbiciae與M.barkeri的co-culture。G.grbiciae與M.barkeri都為嚴格厭氧微生物，而兩種微生物在自制的裝置中都能生長，這充分說明了該裝置在嚴格厭氧微生物的培養時非常有效。

圖5G.grbiciae與M.barkeri的co-cultures耦合代謝乙醇產甲烷

3 結 語

本文設計與制備了實驗室模塊化厭氧微生物培養裝置，并將該裝置用于嚴格厭氧微生物GeobactersulfurreducensPCA及Geobactergrbiciae與Methanosarcinabarkeri800 co-culture的培養，實驗結果表明該裝置完全滿足嚴格厭氧微生物的培養，可用于厭氧微生物的培養、分離純化及篩選。該裝置具有原料易得、模塊化設計、制作簡單、體積可變(0.1～20 L)及使用靈活等優點，其性能達到進口厭氧瓶的要求，但成本遠低于進口厭氧瓶(約為其價格的1/50～1/10)，適用于批量厭氧微生物的培養。本裝置為微生物學、環境微生物技術及發酵工程的實驗教學創造了良好的實驗平臺并取得了很好的效果。通過設計及制備“實驗室模塊化多功能厭氧微生物培養裝置”，不僅改善了學校的實驗教學條件，更重要的是引導學生將所學的金工、機械制圖、AutoCAD及生物學等知識有機結合后應用到一個具體工程項目，有助于培養和提高學生的協同合作、查閱文獻、實驗探索、工程實踐及科技創新能力，最終達到培養學生創新意識、創新精神和創新能力的目的。