男性不育癥患者解脲脲原體感染情況與精液檢查結(jié)果分析

柴蓓蓓 何培 王惠瑩 劉瀏 張若鵬

[摘要] 目的 探討解脲脲原體感染與男性不育癥的關(guān)系以及其對不育癥患者精液檢查結(jié)果的影響。 方法 對2017年5～10月于大理大學(xué)第一附屬醫(yī)院就診的362例男性不育癥患者和同期于我院進(jìn)行健康體檢的100例已生育男性精液的解脲脲原體感染情況、精液常規(guī)情況、血清抗精子抗體情況以及精子DNA碎片化指數(shù)進(jìn)行檢測和分析。 結(jié)果 不育組解脲脲原體陽性率為39.0%，顯著高于對照組（P<0.05）；對照組解脲脲原體陰性者的精液常規(guī)檢查結(jié)果明顯優(yōu)于不育組解脲脲原體陽性者（P<0.05）；不育組UU陽性者血清抗精子抗體檢出率（38.3%）和DNA碎片化指數(shù)（14.9%）顯著高于對照組UU陰性者（P<0.05）。 結(jié)論 解脲脲原體感染可通過降低男性精液質(zhì)量、誘導(dǎo)抗精子抗體產(chǎn)生和損傷精子DNA完整性而影響男性的生育功能。

[關(guān)鍵詞] 不育癥；解脲脲原體；抗精子抗體；精子DNA碎片化指數(shù)

[中圖分類號] R256.5 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-9701（2018）18-0023-04

[Abstract] Objective To investigate the relationship between ureaplasma urealyticum infection and male infertility and its effect on semen test results of infertility patients. Methods The ureaplasma urealyticum infection， semen routine condition， serum anti-sperm antibody， and sperm DNA fragmentation index were detected and analyzed in the semen from a total of 362 male infertility patients who were diagnosed in the First Affiliated Hospital of Dali University from May to October 2017 and 100 males who had children and had undergone physical examination in our hospital during the same period. Results The positive rate of ureaplasma urealyticum in the infertility group was 39.0%， which was significantly higher than that in the control group（P<0.05）. The results of routine examination of semen in the patients with negative ureaplasma urealyticum in the control group were significantly better than those with positive ureaplasma urealyticum in the infertility group（P<0.05）. The detection rate of serum anti-sperm antibody（38.3%） and DNA fragmentation index （14.9%） were significantly higher in the patients with positive UU in the infertility group than in the negative UU in the control group（P<0.05）. Conclusion Ureaplasma urealyticum infection affects male reproductive function by reducing the quality of semen， inducing anti-sperm antibody production and impairing sperm DNA integrity.

[Key words] Infertility； Ureaplasma urealyticum； Anti-sperm antibody； Sperm DNA fragmentation index

隨著生活節(jié)奏的加快和生活壓力的增大，越來越多的人身體處于亞健康狀態(tài)，機(jī)體免疫力降低，使條件性致病微生物得以大量繁殖，繼而引發(fā)疾病。解脲脲原體（ureaplasma urealyticum，UU）是目前發(fā)現(xiàn)的最小的、最簡單的、具有自我繁殖能力的泌尿生殖系定植微生物，有研究表明[1-2]，其已超過衣原體成為非淋菌性尿道炎的最主要致病病原體。而非淋菌性尿道炎與男性精液質(zhì)量和男性不育有著緊密的聯(lián)系，故我們對不育癥患者的解脲脲原體感染情況和精液檢查結(jié)果進(jìn)行分析，以期為不育癥的診斷和治療提供幫助。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2017年5～10月于大理大學(xué)第一附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科的362例男性不育癥患者和同期于我院進(jìn)行健康體檢的100名已生育的男性。（1）納入標(biāo)準(zhǔn)：①不育組：年齡在22～45歲之間的男性；排除女方不孕的因素，夫婦未采取避孕措施，正常性生活1年及以上未能使女方懷孕者。②對照組：年齡在23～50歲之間，于我院體檢，已婚已育的健康男性。（2）排除標(biāo)準(zhǔn)：①存在生殖系統(tǒng)發(fā)育異常、梗阻性無精癥、性功能障礙等不能常規(guī)取精者。②近一個月有感染癥狀或接受過抗生素治療者。③泌尿生殖系存在支原體、沙眼衣原體、淋病奈瑟菌等感染者。（3）一般資料比較：不育組男性平均年齡（33.2±6.4）歲，平均體重指數(shù)（22.8±1.4）kg/m2；對照組男性平均年齡（34.0±7.6）歲，平均體重指數(shù)（23.1±1.7）kg/m2。兩組間年齡和體重指數(shù)比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。

1.2 標(biāo)本的采集與處理

（1）血標(biāo)本：用無抗凝劑采血管抽取血標(biāo)本，并于30 min內(nèi)待其凝固后，3500 r/min離心5 min分離血清備用。（2）精液標(biāo)本：受試者禁欲72 h以上，于我科門診取精室通過手淫法用無菌取精杯完整收集精液標(biāo)記姓名并立即送檢，鏡檢前精液存放于37℃保溫。

1.3 標(biāo)本的檢測

（1）精液標(biāo)本的常規(guī)檢測：使用偉力WLJY-9000彩色精子質(zhì)量檢測系統(tǒng)，按WHO標(biāo)準(zhǔn)對精液標(biāo)本進(jìn)行精子密度、精子活力、精子畸形率的檢測，并人工記錄精液的液化時間。同時將伊紅Y染液和精液各一滴滴于載玻片上并混勻，蓋上蓋玻片，在30 s后于高倍鏡下計數(shù)精子著色情況并計算精子存活率。（2）解脲脲原體的檢測：采用鄭州安圖綠科生物工程有限公司的解脲脲原體液體培養(yǎng)基和質(zhì)控菌株（UU ATCC27813）進(jìn)行解脲脲原體的檢測。嚴(yán)格按照說明操作，將液化后的無菌精液接種在液體培養(yǎng)基上，于37℃條件下培養(yǎng)48 h，培養(yǎng)基內(nèi)液體顏色由黃變?yōu)榧t色或橙紅色，則表明該標(biāo)本解脲脲原體陽性，仍為黃色則提示該標(biāo)本解脲脲原體陰性。（3）精子DNA碎片化指數(shù)（DNA fragmentation index，DFI）的檢測：待新鮮精液液化，用0.1 mol/L 的PBS洗滌3遍后離心，沉淀再次懸濁后，重新調(diào)整精子濃度至5×107/mL，制片自然干燥。將精子涂片浸入固定液固定2 h（甲醇和冰醋酸按3∶1比例配制），再用新鮮配制的吖啶橙工作液染色5 min，并用流水清洗，蒸餾水封片。最后用熒光顯微鏡觀察計數(shù)（日本Olympus BX51，×400），每視野觀察時間小于40 s，共計數(shù)300條精子中紅色和黃色精子的總百分比值。（4）血清抗精子抗體的檢測：采用福建省三明博峰生物科技有限公司生產(chǎn)的抗精子抗體（anti-sperm antibody，AsAb）試劑盒，按說明書操作要求進(jìn)行血清中抗精子抗體的膠體金法檢測。質(zhì)控線和檢測線均呈陽性則表明被檢樣本血清中抗精子抗體陽性；僅質(zhì)控線陽性說明檢測結(jié)果有效，被檢樣本血清中抗精子抗體陰性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS19.0軟件對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，服從正態(tài)分布的數(shù)據(jù)，計量資料以（x±s）表示，行方差分析，計數(shù)資料以[n（%）]表示，行χ2檢驗(yàn)；不服從正態(tài)分布數(shù)據(jù)以中位數(shù)（P25～P75）表示，組間比較采用獨(dú)立樣本秩和檢驗(yàn)（Mann-Whitney U），P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組解脲脲原體檢出情況比較

不育組解脲脲原體陽性率為39.0%，顯著高于對照組的5.0%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表1。

2.2 不育組UU陽性者和對照組精液檢查結(jié)果比較

不育組UU陽性者在精子密度，精子存活率，精子活力方面均明顯低于對照組UU陰性者（P<0.05）；在精子畸形率和精液液化時間方面顯著高于對照組UU陰性者（P<0.05）。對照組UU陽性者精子活力低于對照組UU陰性者，但高于不育組UU陽性者，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表2。

2.3 不育組UU陽性者和對照組血清抗精子抗體檢查結(jié)果比較

不育組UU陽性者血清抗精子抗體檢出率為38.3%，顯著高于對照組UU陰性者的3.2%和對照組UU陽性者的0，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表3。

2.4 不育組UU陽性者和對照組精子DNA碎片化指數(shù)結(jié)果比較

不育組和對照組精子DNA碎片化指數(shù)[DFI（%）]檢查結(jié)果不服從正態(tài)分布，故以中位數(shù)形式表示[M（P25～P75）]，不育組UU陽性者DFI（%）： 14.9（5.7～24.3）；對照組UU陽性者DFI（%）：10.2（4.8～17.4）；對照組UU陰性者DFI（%）：5.2（2.3～8.5）。與對照組UU陰性者相比，對照組UU陽性和不育組UU陽性精子DNA碎片化指數(shù)顯著增高（P<0.05）。

3 討論

3.1 解脲脲原體與男性精液質(zhì)量

解脲脲原體可分為T960生物群和parvo生物群兩個大群，近年來的研究結(jié)果提示[3-4]，T960生物群與男性泌尿生殖系感染的相關(guān)性更為密切，而parvo生物群更可能是定植菌群。本研究結(jié)果表明不育組男性解脲脲原體感染率為39.0%，與近年的研究數(shù)據(jù)相持平[5]，解脲脲原體感染多隱匿，極少出現(xiàn)臨床癥狀，故患者多未察覺或未行治療。解脲脲原體是一類無細(xì)胞膜的原核生物[6]，其原生質(zhì)膜可先與精子細(xì)胞膜融合繼而使其整體融入精子細(xì)胞，但解脲脲原體的原生質(zhì)膜中含有脂類和蛋白類毒性物質(zhì)，其可導(dǎo)致精子細(xì)胞膜的損傷繼而降低精子存活率和精子密度。同時解脲脲原體本身又常附著在精子的頭部和尾部[7-9]，導(dǎo)致精子頸部或尾部畸形影響精子活力，其還會損傷精子頂體、釋放磷脂酶A、磷脂酶C、神經(jīng)氨酸酶樣物質(zhì)等多種生物酶、造成生殖道中激肽釋放減少，減弱精子活力，影響精子運(yùn)動，造成精子畸形，影響精液液化。

3.2 解脲脲原體與抗精子抗體

人類精子抗原可分為精子固有性抗原和精子附著性抗原兩大類[10-11]，誘導(dǎo)抗精子抗體的產(chǎn)生、引起不孕不育的主要是精子附著性抗原，其是由精漿內(nèi)的某些蛋白附著于精子膜上形成的。正常情況下，男性生殖道存在血-生精小管免疫隔離系統(tǒng)，可以防止抗精子自身免疫反應(yīng)的發(fā)生。當(dāng)發(fā)生解脲脲原體感染時[12-13]，炎性反應(yīng)可導(dǎo)致血-生精小管屏障的破壞，病原體繼而入侵損害生精細(xì)胞和曲細(xì)精管基膜，從而使精子抗原外溢導(dǎo)致抗精子抗體的產(chǎn)生。同時解脲脲原體感染還可以使泌尿生殖系的T淋巴細(xì)胞數(shù)目增加、巨噬細(xì)胞吞噬功能增強(qiáng)[14]，進(jìn)一步刺激了機(jī)體對附著解脲脲原體精子的免疫反應(yīng)，從而誘導(dǎo)更多抗精子抗體的產(chǎn)生，導(dǎo)致免疫性不育。但本次研究中對照組解脲脲原體感染者并未檢出抗精子抗體，可見解脲脲原體感染并不是導(dǎo)致抗精子抗體產(chǎn)生的唯一原因，應(yīng)該還存在其他免疫性因素可誘導(dǎo)抗精子抗體的產(chǎn)生[15]。

3.3 解脲脲原體與精子DNA完整性

精子DNA完整性對生育有著非常重要的意義[16]，其影響著從受精到最終胚胎著床發(fā)育這一系列環(huán)節(jié)，在臨床上精子DNA損傷（精子DNA不完整）會導(dǎo)致不孕不育、流產(chǎn)、胎兒異常等不良臨床結(jié)局。目前公認(rèn)的會導(dǎo)致精子DNA損傷的因素包括[17]精子染色質(zhì)的組裝異常、魚精蛋白的缺乏、活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）的增多和精子的異常凋亡等，同時炎癥、高溫和某些藥物亦會導(dǎo)致精子DNA的損傷。Zhang Q等[18]的研究表明，解脲脲原體感染者的精液中ROS水平、丙二醛水平、DNA斷裂指數(shù)均顯著增高而超氧化物歧化酶水平卻有所降低。這些改變可以直接作用于精子膜和精子細(xì)胞或通過凋亡導(dǎo)致精子DNA損傷和碎片化，同時ROS還會影響精子染色質(zhì)的組裝、改變精子中蛋白的表達(dá)、導(dǎo)致精子膜表面離子通道的改變。Ma XP等的研究還發(fā)現(xiàn)[19]解脲脲原體感染者精液的Western Blot結(jié)果提示其附睪精子蛋白P34H表達(dá)水平同精液中透明質(zhì)酸酶的水平呈正相關(guān)，但同精子DNA碎片化率呈負(fù)相關(guān)。附睪精子蛋白P34H作為介導(dǎo)精子-卵透明帶結(jié)合所必需的精子表面蛋白，亦是附睪精子成熟的標(biāo)志物，可見解脲脲原體還可作用于精原細(xì)胞阻礙精子成熟從而損傷精子DNA。

綜上所述，男性泌尿生殖系解脲脲原體感染同不育癥有著密切的聯(lián)系，可通過降低男性精液質(zhì)量、誘導(dǎo)抗精子抗體產(chǎn)生和損傷精子DNA完整性來影響男性的生育功能。但本次研究并未對解脲脲原體（T960群和parvo群）和抗精子抗體（IgA、IgM、IgG）進(jìn)行分型，今后對其進(jìn)行分型研究[20-21]可能有助于解脲脲原體導(dǎo)致的男性不育的防治和進(jìn)一步完善抗精子抗體產(chǎn)生機(jī)制的理論。

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（收稿日期：2018-02-09）