芹菜素對黃嘌呤氧化酶活性的抑制機理研究

（上海震旦職業學院，上海201908）

黃嘌呤氧化酶（xanthine oxidase，XO）是尿酸生成過程中一關鍵酶，主要存在于哺乳動物的乳汁和肝臟中。在人體內，XO能催化次黃嘌呤成黃嘌呤，最終生成尿酸[1]，當XO活性異常活躍時，使尿酸大量的生成和過量積累在血液中，臨床表現為高尿酸血癥，隨著尿酸鹽沉積進而引起痛風的發作[2]。研究顯示，隨著經濟的發展，人民生活水平的提高，飲食結構的改變，高尿酸血癥和痛風的發病率逐年增高，呈年輕化趨勢，并與代謝紊亂、心腦血管疾病等相關[3]。因此抑制XO活性，從源頭減少尿酸的產生是臨床治療痛風的重要手段?，F臨床上應用的XO抑制劑主要是別嘌呤醇，然而可能會引發一些不良反應，如引起過敏及抑制骨髓，對部分充血性心臟功能不全的高尿酸血癥患者不利等，這在一定程度上限制了它的臨床應用[4]。因此研究新的低毒、少副作用的XO抑制劑具有十分重要的意義。天然產物有效成分的XO抑制劑來源廣泛，安全性高，因此引起了廣泛的關注。

目前，黃酮類化合物在醫藥和食品方面有重要的應用。天然的黃酮類化合物有多種生物活性[5]，例如清除自由基、抗氧化、抗菌、抗病毒、保護肝臟、抗腫瘤、抗血栓、保護心肌和降血脂等作用。此外，研究表明，有些黃酮類化合物還能抑制XO的活性，從而抑制尿酸的合成以及一系列生理性損傷[6-7]。作為一種黃酮組分，芹菜素又稱芹黃素、洋芹素，廣泛分布于溫熱帶的蔬菜和水果中，尤以芹菜中含量為高；在一些藥用植物如車前子、絡石藤等中也有很高的含量，植物源性飲料如茶、酒以及一些調味品中也有分布[8-9]。有文獻報道芹菜素對XO也具有較好的抑制活性[10]，但其對XO的抑制機理尚未見深入的研究，因此本試驗利用多種光譜連用的方法（紫外光譜、熒光光譜和圓二色譜等）結合分子對接技術來探究芹菜素對XO活性的抑制機理，為芹菜素在臨床上的應用提供理論依據，有助于深入分析芹菜素對黃嘌呤氧化酶的作用機制和進行藥物的臨床應用評價。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

美國黃嘌呤氧化酶（編號X4500-5UN，酶活1.0 units/mg～2.0 units/mg，來源于牛奶）：Sigma公司；芹菜素（純度≥98.0%）、根皮素（純度≥99.0%）、別嘌呤醇（純度≥98.0%）、黃嘌呤（純度≥99.5%）：上海阿拉丁試劑有限公司；其它試劑均為分析純。

pH211型精密pH計：意大利HANNA公司；UV-2550型紫外–可見分光光度計：日本SHIMADZU公司；F-4500型熒光光度計：日本Hitachi公司；J-810型圓二色譜儀：日本JASCO公司。

1.2 方法

1.2.1 芹菜素抑制XO的酶活測定

采用Wang等[11]的方法進行酶活測定，并在此基礎上稍作修正。XO催化黃嘌呤產生的尿酸在295 nm處有特征吸收峰，利用UV-2550型紫外-可見分光光度計的動力學版塊，將固定濃度的XO溶液（7.5×10-8mol/L）與含有不同濃度芹菜素（根皮素）溶液混合，制備一系列3 mL的反應體系（在pH 7.4，0.05 mol/L，Tris-HCl緩沖液中），置于37℃水浴孵化3 h，待反應達到平衡，加入底物黃嘌呤溶液（最終濃度為5.0×10-5mol/L）啟動反應，25℃下，以空白作對照，每隔15秒測定體系在295 nm處的吸光度，每種濃度做3個平行。

通過關系式：相對活性/%=（R/R0）× 100，計算 XO的相對活性，以別嘌呤醇作為陽性對照。

式中：R0為無抑制劑時吸光度變化率；R為在含有不同濃度抑制劑體系中吸光度變化率。以未加抑制劑組的酶活力為100%。

1.2.2 芹菜素對XO活性的抑制動力學研究

在上述相同條件下，固定XO的濃度（7.5×10-8mol/L），測定不同濃度芹菜素體系（0、2.5、5.0、10.0 μmol/L）中，不同濃度底物黃嘌呤（2.5、5.0、10.0、20.0×10-5mol/L）對反應速率的影響，每種濃度做3個平行，并以Lineweaver-Burk雙倒數方程作圖，判斷芹菜素對XO抑制作用的可逆性和抑制類型，并求出抑制常數（Ki）和抑制系數（α）。

1.2.3 芹菜素與XO作用的熒光光譜研究

在3 mL反應體系（Tris-HCl緩沖液）中，固定XO濃度（5.0×10-7mol/L），依次滴加一定量的芹菜素溶液（3 μL/次，使濃度逐漸增加）并混合均勻，待靜置3 min，分別掃描游離XO和芹菜素-XO混合體系的熒光光譜。掃描條件：激發波長280 nm，激發和發射狹縫均為5 nm，掃描范圍300 nm～500 nm。

1.2.4 圓二色譜測定

在上述緩沖介質中，分別掃描游離XO以及芹菜素-XO樣品溶液（摩爾比1∶1和2∶1）的圓二色譜。掃描條件：波長范圍為190 nm～250 nm，掃描速度為60 nm/min，以相同緩沖液做空白。再通過在線Dichroweb 軟 件（http：//dichroweb.cryst.bbk.ac.uk/html/home.shtml）計算XO的二級結構含量變化[12]。

1.2.5 分子對接

從Protein Data Base數據庫下載XO的晶體模型（PDB ID：3ETR），從Pub Chem數據庫下載芹菜素的3D結構，分別進行優化處理。再通過AutoDock 4.2分子模擬軟件進行100次結合模擬，選出最佳結合構象進行分析。

2 結果與分析

2.1 芹菜素對XO活性的抑制作用

芹菜素對XO的抑制作用見圖1。

圖1 芹菜素對XO的抑制作用Fig.1 Inhibitory effect on XO of apigenin

如圖1所示，在一定濃度內，隨著芹菜素的不斷加入，XO的相對活性逐漸降低直至20%，芹菜素對酶的抑制作用呈現一定的濃度依賴關系，是有效的XO抑制劑；而根皮素只將相對酶活抑制到75%，最后趨于平緩，表明根皮素不是有效的XO抑制劑。分析其結構，根皮素與芹菜素的結構差異只在于缺少一個2-苯基色原酮結構，由此可見黃酮組分芹菜素中的2-苯基色原酮結構是抑制XO活性的重要結構[10]。此外，芹菜素和陽性對照別嘌呤醇的IC50分別為（8.63±0.03）μmol/L和（3.02±0.02）μmol/L（n=3），數量級相同，表明芹菜素具有較好的抑制XO活性的潛力。

2.2 芹菜素對XO的抑制動力學分析

通過酶反應動力學方法，用酶促反應速度υ（ΔOD）對酶濃度作圖：當不存在抑制劑時，速率直線通過原點；當有可逆性抑制劑存在時，因抑制劑的量恒定，可得到一條通過原點而斜率較低的直線[11]。芹菜素對XO的抑制類型見圖2。

圖2 芹菜素對XO的抑制類型Fig.2 Inhibitory type of apigenin on XO

圖2顯示，每個抑制劑濃度下的直線都經過原點，且隨著芹菜素濃度的增加直線的斜率不斷降低，表明芹菜素對XO的抑制是一個可逆的過程。按照動力學方法區分抑制劑對酶的可逆性抑制作用，以及抑制劑、底物和酶之間的相互關系，可逆性抑制又可分為競爭性抑制、非競爭性抑制、反競爭性抑制和混合競爭型抑制。采用Lineweaver-Burk雙導數法作圖，判斷芹菜素對XO的抑制作用類型，結果見圖2，測得的l/υ-1/[S]關系為一組相交于第二象限的直線，這說明芹菜素對XO是一種混合競爭型抑制劑[12]。對這種抑制類型，再分別以直線的斜率和Y-截距對芹菜素濃度二次作圖，如圖2所示，直線線性關系較好，表明芹菜素在XO上只有一個或一類結合位點[13]，再計算得出Ki=（2.35±0.42）μmol/L 和 α=（4.07±0.06）μmol/L。

2.3 芹菜素與XO的相互作用

一般情況下，在激發波長為280 nm時，蛋白質在340 nm附近有一個主要的熒光發射峰（主要因為蛋白質中色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸等熒光發射基團）。圖3是不同濃度芹菜素存在下XO熒光發射光譜。

圖3 不同濃度的芹菜素對XO熒光光譜的影響Fig.3 Effect of apigenin on fluorescence spectra of XO at different concentrations

芹菜素沒有內源熒光，而隨著芹菜素溶液不斷加入，XO的熒光強度有規律地降低，并且最高峰的峰位出現了略微藍移，這說明芹菜素與XO之間發生了相互作用，并由此影響了XO內熒光發色氨基酸周圍微環境，使其疏水性增強[14]。

為了進一步闡明猝滅機理，在研究中利用Stern-Volmer方程對試驗數據進行分析[15]：F0/F=1+Kqτ0[Q]=1+Ksv[Q]，lg（F0-F）/F=lgKa+nlg[Q]，式中：F0和 F 分別為未加入和加入芹菜素時XO的熒光強度；Kq為雙分子猝滅過程速率常數；KSV為猝滅常數；[Q]為芹菜素的濃度。并根據熱力學公式：lgKa=-ΔH/2.303RT+ΔS/2.303R，ΔG= ΔH-TΔS，計算焓變（ΔH）、熵變（ΔS）和吉布斯自由能變（ΔG）。根據反應前后熱力學焓變ΔH和熵變ΔS的相對大小，可以判斷芹菜素與XO大分子相互作用的主要作用力類型[16]。結果列于表1。

表1中，Ksv隨著溫度的升高而減小且猝滅速率常數Kq值均遠大于生物分子的最大擴散速率常數值（2×1010L/（mol·s），這表明芹菜素對XO熒光猝滅為典型的形成復合物的靜態猝滅過程；結合常數（Ka）隨溫度升高而增大，說明復合物的穩定性隨溫度升高而增強；結合位點數（n）均趨于1，表明芹菜素在XO上存在唯一的結合位點，這與抑制動力學試驗結果吻合。

根據ΔG＜0，表明芹菜素與XO的作用過程是一個Gibbs自由能降低的自發過程；ΔH＞0、ΔS＞0，說明形成復合物是熵驅動的吸熱反應，揭示芹菜素與XO結合的主要驅動力為疏水作用力[12]。

不同溫度下芹菜素-XO體系的猝滅常數（Ksv）、結合常數（Ka）、結合為點數（n）及熱力學參數見表1。

2.4 芹菜素對XO二級結構的影響

圓二色譜是研究蛋白質二級結構變化的有效工具，圖6為芹菜素與XO相互作用的圓二色譜圖，XO出現兩個負的特征峰譜帶是α-螺旋結構的特征峰，并隨著芹菜素濃度增大，圖譜中特征負峰減小，且峰位峰形都沒有顯著變化，表明XO分子中α-螺旋結構發生變化但仍占主導地位。在線SELCON3程序算得XO二級結構含量的值列于表2，可見，當芹菜素與XO的摩爾比增大時（從 0∶1，1∶1到 2∶1），α-螺旋（從36.8%、40.3%到47.6%）和β-折疊（11.8%、13.1%到14.4%）的含量都升高，而β-轉角（從26.3%、23.9%到20.6%）和無規卷曲（25.1%、22.7%到17.7%）含量逐漸降低，說明芹菜素的加入誘導XO的二級結構發生部分改變，并且α-螺旋作為主要結構，含量增加可能使XO的二級結構更加緊密，這不利于酶形成活性中心以及底物進入活性中心。

表1 不同溫度下芹菜素-XO體系的猝滅常數（Ksv）、結合常數（Ka）、結合為點數（n）及熱力學參數Table 1 Quenching constant（Ksv），association constant（Ka），binding sites（n），and thermodynamic parameters of apigenin-XO system at different temperature

表2 XO和芹菜素-XO體系的蛋白質二級結構含量Table 2 Secondary structure contents of XO and apigenin-XO systems

2.5 分子模擬

計算機分子對接方法可形象地展現出配體與生物大分子的結合情況，這有助于從理論上確定其相互作用的機理和模式。芹菜素與XO分子對接團簇分析見圖4，芹菜素與XO分子對接見圖5。

如圖4，按最佳能量原理，結合能最低（-6.15）結合次數最多（33次）的結合構象最穩定，所得的最佳構象如圖5所示，該圖僅顯示了XO活性空腔內配體芹菜素周圍氨基酸殘基（Phe 649/1009/1013、Leu 648/873/1014、Glu 802/879、Arg 880、Ser 876、Thr 1011 等），并與陽性對照別嘌呤醇的位置進行對比。從圖中可看出，與別嘌呤醇一樣，芹菜素的剛性雙環結構嵌入XO的疏水腔，而這阻礙了底物分子進入活性中心的通道，由此降低了酶的催化活性。而且芹菜素的疏水結構被疏水氨基酸包圍（Leu 648/873/1014，Phe 649/1009/1013），說明芹菜素與XO之間存在疏水作用[11-12]，這與熱力學研究結果基本一致。再者，考慮到其間近距離，芹菜素苯環結構與周圍的芳香族氨基酸（Phe 649/1009/1013）的苯環之間可能存在π-π堆積作用，這有利于配體的結合。圖中還顯示芹菜素與XO的Leu 873、Phe 649之間形成了氫鍵，鍵長分別為3.37 ?和3.16 ?，進一步利于芹菜素穩定在空腔中。

圖4 芹菜素與XO分子對接團簇分析Fig.4 Cluster analyses of the AutoDock docking runs of apigenin with XO

圖5 芹菜素與XO分子對接Fig.5 Molecular docking between apigenin and XO

3 結論

芹菜素具有良好的XO活性抑制效果；通過研究抑制動力學特點，明確芹菜素對XO具有明顯可逆的混合競爭型抑制作用，其半抑制濃度IC50為（8.63±0.03）μmol/L，抑制常數 Ki為（2.35 ± 0.42）μmol/L。再結合芹菜素與XO相互作用進行分析，芹菜素抑制XO活性的機理為：芹菜素進入XO的疏水腔，通過疏水作用力與XO活性中心周圍的主要氨基酸殘基發生作用；并引起XO的二級結構發生改變，α-螺旋含量增加使得XO的結構更加緊密而不利于底物進入疏水空腔；同時，芹菜素占據底物進入活性中心的通道，也有效地抑制XO對黃嘌呤的催化活性。