老年根齲患者唾液菌群多樣性初步分析

楊會肖 呂胡玲 陳慧姍 吳紅崑

根齲是老年人群中常見的口腔疾患，據第三次全國口腔健康流行病學調查顯示，我國65～74歲的老年人群中根齲的患病率高達63.6%[1]。根齲進展迅速，治療不及時常常會累及牙髓或根尖周組織，造成疼痛，甚至失牙，嚴重危害老年人的口腔及全身健康，降低生活質量[2]。目前公認的齲病致病機制為口腔菌群失衡學說[3-4]，該學說認為：某些口腔微生物產酸引起牙面環境酸化，口腔微生態環境發生改變，產酸或耐酸菌的定植增加，引起牙齒表面脫礦與再礦化過程發生失衡，導致牙體硬組織崩解和牙本質的有機基質暴露；同時，酸環境還可以活化機體內的蛋白酶導致暴露的牙本質基質不斷發生降解。口腔微生物菌群的相互作用共同促進了齲病的發生及發展。

目前，已知人類口腔中存在的細菌約700種[5]，其中超過一半是用傳統分離培養技術無法培養的。Preza等[6]利用克隆測序的方法對根齲牙菌斑進行研究發現，除了變異鏈球菌、乳酸桿菌及放線菌外，糞腸球菌、阿托波菌、歐陸森氏菌、擬溶半乳桿菌、Pseudoramibacter alactolyticus，以及丙酸桿菌屬和月形單胞菌屬的個別細菌株均與根齲的發生密切相關，揭示了根齲相關細菌的復雜性和多樣性；但其他研究卻得出了不同的結論[7-8]，因此，有必要對根齲相關細菌進行進一步的探討。

唾液是口腔內細菌的天然載體，是形成牙菌斑的外部環境。已有的研究表明，唾液中微生物的種類決定了牙面上菌群的定植模式[9]，罹患牙周病或齲病的人群，其唾液微生物群落與健康人存在顯著差異[10]；同時唾液微生物群落結構相對穩定，唾液取樣簡單，無痛，具有無創性，因此，常常被用于口腔微生物多樣性的研究[11]。但目前這些研究多集中于兒童或中年人，且主要針對冠部齲，目前，尚未見到有關根齲與唾液微生物群落組成關系的研究。

區別于傳統的培養方法，以聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction,PCR)為基礎的高通量方法如變性梯度凝膠電泳(denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE)，可以不必對原始樣本進行培養而直接提取基因組DNA，分析細菌群體在基因水平和代謝水平上的多樣性，監測微生物群落的動態變化，以及發現新的口腔微生物物種等[12]。本研究采用PCR-DGGE指紋圖譜技術初步探討不同根齲狀況的老年人唾液微生物群落的多樣性變化，尋找根齲相關優勢菌群，期望為老年人根齲的預測及防治提供一定理論依據。

1.材料與方法

1.1臨床材料 隨機抽樣總體為參加2012年5月～2013年7月度四川大學華西醫院全身體格檢查的65歲以上老年人，年齡65～92歲。實驗分為2組：根齲組：根齲牙面數(Root caries surface,RDS)≥1，n=10；健康對照組：n=10。根齲的診斷標準[13]為：齲損質軟或皮革感，齲損位于根面上或釉牙本質界處但大部分位于根面上，包括原發齲和繼發齲。總納入標準：全身健康狀況良好，精神狀況正常，無長期服藥史，未罹患糖尿病、高血壓、舍格倫綜合癥等系統性疾病，未接受頭頸部術后放化療等，采樣前2個月未服用抗生素，抗菌漱口液及免疫抑制劑，口腔衛生較好，牙齦健康，除根齲外，無其他明顯口腔感染性疾病如牙周病、牙髓炎、口腔黏膜疾病及腫瘤等，剩余牙數大于18顆，無長烤瓷橋修復。

1.2樣本采集 經四川大學華西醫院倫理道德委員會批準，研究對象或其監護人在取樣前均簽署知情同意書。由同一名操作者于上午8時左右分別收集2組人群非刺激性全唾液2～3mL，取樣前均禁水禁食，自然口含唾液數分鐘后讓唾液自行流入無菌EP管中，-80℃冰箱中凍存備用。

1.3 DNA的提取和PCR擴增 將唾液樣本在室溫下化凍，離心，收集細菌沉淀。使用Master PureTMDNA Purification Kit(Epicentre Biotechnologies公司，美國)提取唾液樣本中細菌全基因DNA作為模板。選用通用引物Bac1和Bac2對細菌的16Sr RNA基因V3區進行擴增，其中Bac1引物5′端連接40bp的“GC夾”，序列如下。Bac1:5′-CGCCCG CCGCGCCCCGCGCCCGTCCCGCCGCCCCCG CCC GAC TAC GTC CCA GCA GCC-3′，Bac2:5′-GGA CTA CCA GGGTAT CTA ATCC-3′，擴增產物長度約為300bp。2%普通瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物。

1.4變性梯度凝膠電泳 (DGGE)PCR擴增產物通過DCodeTMUniversal Mutation檢測系統(Bio-Rad公司，美國)進行變性梯度凝膠電泳[12]。聚丙烯酰胺凝膠質量分數為8%(w/v)，變性劑濃度梯度質量分數為30%～70%。電壓恒定條件下，在1×TAE緩沖液(pH 8.5)中電泳16h。電泳完成后，溴化乙錠的染色，后于凝膠成像系統(Bio-Rad公司，美國)采集DGGE凝膠的數碼圖像。

1.5 DGGE凝膠圖像分析 采用Quantity One1-D分析軟件4.6.2(Bio-Rad公司，美國)對電泳圖像進行分析。DGGE圖譜進行優化處理后，識別、調整泳道及條帶，進行條帶配對，并對圖譜中的條帶進行半定量分析，采用豐富度(S)和Shannon-Wieners指數(H’)反應群落的多樣性。使用非加權平均法(unweighted pair-group method with arithmetic mean,UPGMA)進行聚類分析構建系統進化樹。

1.6切膠回收及序列測定 選擇特征性條帶進行切膠回收，回收產物以Bac1/Bac2通用引物進行再富集，擴增產物送大連TaKaRa生物公司進行克隆、測序。測序結果于人類口腔微生物組數據庫(HOMD，http://www.homd.org)，美國國立生物信息中心(NCBI，http://ncbi.nlm.nih.gov)和RDPⅡ數據庫(Ribosomal database project，http://rdp.cme.msu.edu)中進行BLAST檢索比較，一致性達到98%-100%的序列被認為具有陽性指示意義。

1.7統計學分析 使用SPSS13.0軟件，采用單因素方差分析(ANOVA)比較組間豐富度(S)及Shannon-Wieners指數(H’)差異，顯著性水檢驗標準為P＜ 0.05。

2.結果

2.1 DGGE圖譜總體特征 根齲與無齲組老年人群唾液微生物群落的DGGE圖譜見圖1，每個電泳條帶代表1個樣本，同一位置水平的條帶代表1種細菌的基因型。實驗具有可重復性，Sorensons相似系數為0.87。兩組人群唾液細菌的組成具有多樣性和個體差異性，圖譜表現為未見到完全相同的泳道出現。

圖1 唾液菌群的PCR-DGGE圖譜

3.2條帶類型分析 共發現34個不同類型的條帶(圖2，Band type1-34)，各泳道條帶數介于16～28之間，平均條帶數為19.85±2.56。其中有9個條帶(Band type 1,3,13,16,20,21,22,23,24)在約80%以上樣品中都有出現，其中Band type3,13,16,21的檢出率為100%，推測它們可能是老年人群口腔常駐菌群；6個條帶在兩組的分布有顯著差異，其中band type 5,27,32在健康組的絕大多數樣本里均能檢出(檢出率，5(90%)，27(90%)，32(80%))，而在根齲組檢出減少(檢出率，5(50%)，27(40%)，32(40%))。Band type 25在根齲組的檢出率為100%，在健康組僅檢出2例(檢出率，20%);而band14，34在根齲檢出率均達到80%，在健康組的檢出頻率則下降至30%，甚至更低(檢出率，14(30%)，34(20%))。這6個條帶分別對應圖1中A,B,C,E,D,F,切膠回收后進行克隆測序。

圖2 條帶類型分析圖

2.3多樣性分析 采用豐富度(S)和Shannon-Weaver指數(H’)來分析2組人群的多樣性。物種豐富度(species richness,S)是指群落所包含的物種數目，表明群落或微生態環境中物種數目的多寡[14]。本實驗中豐富度以泳道中所有條帶數目表示。H’的計算是基于DGGE凝膠條帶的位置和條帶的強度(圖3)，計算公式為H′=∑piln(pi),(pi=ni/N)，其中ni為單個條帶的光密度，N為所有條帶的光密度[14]。老年無齲組唾液細菌的豐富度SNRC為20.90±2.92，而根齲組老年人唾液細菌的平均條帶數SRC為18.80±1.69，但兩組豐富度無明顯統計學差異(SNRC：SRC，P=0.103)；根齲組和無齲組老年人唾液菌群的Shannon-Wieners指數(H’)則分別為2.52±0.17和2.73±0.1，兩者之間的差異存在統計學意義(P＜0.05)。

圖3 DGGE圖譜各條帶相對強度的數字化示意圖

3.4 UPGMA分析 UPGMA聚類分析結果(圖4)表明，除泳道16和19外，健康組內大部分樣本(泳道 18，14，12，20，11，15，17，13)聚類到鄰近位置，Dice’s相似系數為0.61；而根齲組除了泳道1和7外，大部分樣本，(泳道2-6，8，9，10)亦聚類到鄰近的不同位置，兩組人群唾液微生物群落結構都表現出較高內部相似性。

圖4 UPGAM系統發育樹

3.5條帶回切測序結果 A-F每個條帶選取2個陽性克隆進行測序，得到了種屬、甚至株級別的微生物信息，測序匹配度高達98%以上(表1)。異發酵乳桿菌DSM5705(Lactobacillusmalefermentans strain DSM 5705)、未獲培養的真細菌屬克隆clone IS017B74/IS013B55(Uncultured Eubacterium sp clone IS017B74/IS013B55)及頰纖毛菌C-1013-b(Leptotrichia buccalis C-1013-b)在根齲組檢出率高于正常組；而副流感嗜血桿菌T3T1(Haemophilus parainfluenzae T3T1),奈瑟菌屬11-26360(Neisseria sp.11-26360)和某種未獲培養的細菌(Uncultured bacterium clone ncd2240d01c1)在正常組檢出較頻率更高。

表1 回切條帶測序比對結果

3.討論

根面齲是老年口腔疾患中最常見、危害較大的疾病之一，它具有廣泛的流行性，臨床損害的特殊性及防治的復雜性，需要特別注意。口腔微生物菌群與宿主的相互作用同口腔疾病的發生和發展密切相關，以群落和微生物生態為基礎對口腔微生物菌群進行探討不僅為理解根齲的病因學提供了新的視角，也為根齲的防治提供了新的手段。

本研究采用PCR-DGGE技術對根齲及口腔健康老年人唾液微生物群落進行總體分析，DGGE指紋圖譜共獲得34種不同位置的條帶，直觀地顯示了不同個體唾液微生物的組成具有多樣性及差異性。DGGE圖譜分析發現，老年根齲組的口腔微生物豐富度較老年健康組有減少的趨勢(組SRC=18.80±2.94；SNRC=20.90±2.51)，但差異不明顯；而老年根齲患者唾液菌群的另一多樣性指數-Shannon-Wieners指數(H’)(H’RC=2.52±0.17；H’NRC=2.73±0.18)則顯著小于正常者。因為Shannon指數除了包括種數外，還包括各種間個體分配的均勻性(equability或evenness)。各種之間，個體分配越均勻，H’值就越大。如果每一個體都屬于不同的種，多樣性指數就最大；如果每一個體都屬于同一種，則其多樣性指數就最小，因此與豐富度的簡便直觀相比，Shannon指數更能真實地反映多樣性，因此，我們認為老年根齲患者唾液微生物菌落多樣性減少。根齲組唾液細菌的多樣性較正常組有減少的趨勢，這與Li等[15]的研究結果一致。而條帶類型分析則發現，6個條帶(band type 5,27,32,25,14,34)在兩組人群唾液中均可檢出，但檢出頻率差異較大。這些發現都再次驗證了齲病的口腔菌群生態失衡學說，即齲病的發生并不是由于某種致病菌的出現或者整個口腔微生物數量增多導致，而是隨著口腔微生態環境的改變，導致一部分細菌的生長繁殖被抑制，數量減少或消失，而另一部分細菌則大量繁殖，轉變為條件致病菌，從而導致齲齒的發生[16]。

結合特征條帶測序結果，研究發現，頰纖毛菌C-1013-b(band type25)可以在老年根齲組唾液樣本中100%被檢出，這與Ling等[17]針對兒童齲病患者唾液菌群的研究一致。已知頰纖毛菌可以與韋榮菌及變鏈菌發生共聚，作為它們黏附于牙面的支架[18]。但Preza等則發現在健康根面菌斑中纖毛菌的檢出比例更高[11]。但頰纖毛菌C-1013-b是可以培養的，因此使得對它的理化性能及其與根齲的關系進行進一步探討成為可能。已知真細菌包含較多種類，有學者指出Eubacterium saburreum可以與Veillonella spp.發生共聚幫助其黏附到牙面上導致齲病的發生[19]，但也有研究指出Eubactrium.saburreum clone GT038，Eubacterium sp.clone EI074，Eubacterium sp.clone DO016等與口腔健康密切相關[20]，提示我們不同的細菌株可能具有完全不同的生物特性，因此，有必要從基因型水平對微生物的毒力因子進行探討。本研究發現，某種未獲培養的真細菌屬克隆clone IS017B74/IS013B55(band type 34)在根齲組樣本中的檢出率高于健康人群，這與Preza等所得出的結論一致[11]，同時這些種屬級別，甚至株級別微生物信息的獲得，也證實了DGGE在研究微生物多樣性方面的實用性。另外，本研究首次發現了唾液中異發酵乳桿菌DSM 5705(band type 14)在根齲組唾液中的檢出率亦遠高于健康組。異發酵乳桿菌可以代謝葡萄糖等生成乳酸，且產酸能力較發酵乳桿菌更強[21]，其最適pH值范圍為4.1-6.9，但目前其與根齲發生的關系尚未見報道。除此之外，本試驗也證實了副流感嗜血桿菌T3T1(band type5)和奈瑟菌sp.11-26360(band type 32)與健康的口腔狀況關系密切[21,8,10]。由于唾液微生物菌群結構的相對穩定性及唾液取樣無創方便的優勢，因此唾液微生物常常被作為口腔疾病檢測的分子生物學標記。本文發現有6個菌株在兩組人群中的分布存在明顯差異，或許可以為根齲的唾液檢測提供一定的理論依據。

根據聚類分析的結果，我們無法將根齲及健康老年人唾液微生物分成2個截然不同的群落，可能與本研究樣本量有關，或例外樣品的存在有關。由于宿主的選擇作用，唾液微生物群落本身就具有個體獨特性[22]。但是，本文發現健康老年人唾液微生物相似性(Dicer系數為0.61)高于根齲組，提示可能有穩定的唾液微生物菌群存在，它們對于維持老年人口腔健康十分重要。因此老年人應定期進行口腔檢查及口腔衛生保健，維護良好的口腔生態平衡，保持口腔健康。