固體納米孔分析技術的研究進展

李志 劉麗萍 房真 郗冬梅

摘 要 納米孔分析技術是一種低成本、無需熒光標記和擴增的單分子檢測技術，其中基于固體材料的納米孔由于穩定性高、耐受性好、尺寸可控、易于修飾等優點，在化學和生命科學等領域得到廣泛應用。固體納米孔主要由薄膜和管材料兩種類型材料制備，其中常見的薄膜納米孔包括氮化硅、二維材料、氧化鋁以及聚合物薄膜，管材料主要包括玻璃毛細管和碳納米管。本文總結了固體納米孔分析技術的研究進展，展望了發展前景。

關鍵詞 固體納米孔； 單分子分析； DNA測序； 評述

1 引 言

納米孔分析技術是從20世紀90年代中期開始發展起來的單分子分析手段。1996年，研究人員首次利用α-溶血素天然生物通道蛋白獲得寡核苷酸的阻斷電流信號[1]，開啟了納米孔研究的熱潮。該技術憑借其快速、低成本、無需熒光標記等優勢，在化學和生物等研究領域廣泛應用。目前納米孔分析技術不僅用于DNA測序，在單分子傳感分析領域也取得了令人矚目的成績。根據分子穿過納米孔時產生的特征性阻斷電流信號，可實時獲取待測物的結構、組成、尺寸、電荷、構象以及與其它分子相互作用的動力學信息。多種生物膜蛋白，包括氣單胞菌溶素（Aerolysin）[2，3]、恥垢分支桿菌（MspA）[4]、大腸桿菌細胞溶素A（ClyA）[5]、鐵異羥肟酸提取組分 A（FhuA）[6]、噬菌體phi29 DNA-裝配馬達[7]和超穩定蛋白1（SP1）[8]等都已被用于構建生物納米孔道，極大地拓寬了生物納米孔傳感技術的應用范圍，已有相關文獻對其進行了綜述介紹[9-11]。

隨著微加工技術的迅速發展，研究人員分別以氮化硅[12，13]、石墨烯[14，15]、氧化鋁[16]、聚合物薄膜[17]、玻璃毛細管[18]、碳納米管[19]等為材料，成功制造了固體納米孔。由于材料不同，制備固體納米孔的方法也不同，常用的主要有離子束雕刻[20]、電子束鉆孔法[21]、原子層沉積法[22]和徑跡刻蝕法[23]等，對此Dekker[24]、Matile[25]和Li[26]等都做過較為全面的文獻綜述。本文主要總結了近年來常用的固體納米孔的種類及在DNA測序和生物傳感中的應用研究進展。

2 固體納米孔的種類及應用研究進展

固體納米孔因其穩定性高、耐受性好、尺寸可控、易于修飾等優點，被廣泛用于DNA測序研究以及核酸、蛋白質、小分子等的單分子檢測。目前，固體孔主要由薄膜和管型兩種不同類型的材料制備而成。

2.1 薄膜納米孔

薄膜材料由于具有特殊的界面結構，成為制備固體納米孔的優良材質，常用的薄膜材料包括氮化硅、二維材料、氧化鋁以及聚合物薄膜等。

2.1.1 氮化硅 2001年，Golovchenko課題組首次使用離子束在氮化硅（Si3N4）薄膜上制備出固體納米孔[20]，并應用于DNA分子檢測，打開了固體納米孔檢測技術的大門。他們首先在自支撐的氮化硅薄膜反面通過反應離子刻蝕制造一個碗型的凹槽，再使用帶反饋控制的Ar+離子束從正面減薄凹槽區域，直到薄膜擊穿形成納米孔，孔徑約為60 nm，進一步利用氬離子束輻射能夠將孔徑收縮至1.8 nm。

氮化硅納米孔因具有結構致密、疏水性、化學穩定性好、介電常數大等優良特性，已被廣泛用于DNA[27]和microRNA識別[28，29]、修飾堿基區分[30]、DNA-蛋白質復合物過孔動力學研究[31]、蛋白質過孔行為分析[32]以及核小體亞結構檢測研究[33]。2010年，Wanunu等[21]使用電子束曝光和SF6等離子干法刻蝕的方法制造出厚度僅為6 nm左右的SiN薄膜，其上包含一個直徑為3 nm的納米孔，成功實現了對microRNA的特異性識別。隨后該課題組進一步制造出厚度5～8 nm的SiNx薄膜，納米孔的直徑介于0.8～2.0 nm之間，實現了poly（dA）30、poly（dC）30和poly（dT）30的有效區分[34]。最近，Long課題組可控制備了直徑< 2 nm 的SiNx納米孔道，并獲得了單個DNA 發夾結構的納米孔道特征解鏈信號[35]，證明所制備的SiNx 納米孔檢測靈敏度與α-溶血素生物納米孔相當。 Plesa等[13]利用SiN納米孔道實現了單鏈DNA和打結的單鏈DNA、環狀DNA和打結的環狀DNA的高靈敏分辨，根據DNA穿越納米孔時的特征電流信號，能夠識別任意長度的線性或環狀DNA內部的節點（圖1），為研究長鏈DNA的拓撲結構開拓了新思路。

2.1.2 二維材料 二維材料得益于其原子級厚度的優勢，成為制造納米孔的理想材料。典型的二維材料主要包括石墨烯、氮化硼、二硫化鉬等。石墨烯薄膜是一種具有獨特電子和機械性能的單層碳原子層[36，37]，厚度與DNA分子鏈中相鄰堿基之間的距離（約0.34 nm）相當，因此成為納米孔測序技術中的首選材料。2010年，Golovchenko[38]、Dekker[39]和Drndic[40] 3個課題組開始了利用石墨烯納米孔檢測雙鏈DNA的工作，發現通過石墨烯納米孔的離子電流基底噪聲較大，使用原子層沉積技術在石墨烯納米孔表面沉積氧化鈦能夠有效提高石墨烯納米孔檢測的信噪比。進一步， Schneider等[41]通過在石墨烯表面自組裝親水物質從而阻止石墨烯對單鏈DNA的吸附，實現了單鏈DNA的檢測。但是，目前納米孔用于DNA測序存在巨大的挑戰，一方面DNA分子在納米孔內的遷移速度太快，高達0.01～1.00 μs/堿基[15]； 另一方面，石墨烯納米孔表現出很高的1/f噪音[42]，無法實現單個堿基的精確分辨。

為了解決上述問題，很多研究者尋找納米孔測序的新途徑。最近，Dekker課題組制備了短而窄的石墨烯納米帶（30 nm × 30 nm），其上包含一個5 nm的納米孔，通過分析石墨烯納米孔的平面電流信號（非傳統的離子電流信號），研究了DNA分子穿過納米孔的行為（圖2）[43]，這種方法能夠獲得較大范圍的電流信號，促進高帶寬檢測，從而克服傳統方法由于帶寬過低而難以捕捉到快速過孔的電流信號的問題。此外，氮化硼和二硫化鉬等新興二維材料相繼被開發。Liu等[44]首先在氮化硼薄膜上使用聚焦電子束制備出直徑5 nm的納米孔），用于雙鏈DNA分子的檢測，靈敏度比SiN納米孔更高，空間分辨率與石墨烯納米孔相當。Liu等在二硫化鉬薄膜上制造出直徑5 nm的納米孔，分析了具有豐富二級結構的λ-DNA分子的過孔行為，表現出比傳統SiNx 更高的靈敏度[45]。Feng等[46]進一步在單層二硫化鉬上制備出直徑2.8 nm的納米孔，通過控制液體的粘度梯度降低DNA穿越納米孔的速度，從而實現了對poly（dA）30、poly（dC）30、poly（dG）30和poIy（dT）30 4種不同核苷酸的分辨。這些二維材料在生物分子識別方面表現出相當高的檢測精度，但如用于DNA測序，仍需進一步研究探索。

2.1.3 氧化鋁 多孔氧化鋁是一類應用廣泛的無機陣列納米通道，一般通過陽極氧化法制備，即將鋁片置于酸性電解液中，控制一定的電壓、電流條件使其電解形成陽極氧化鋁薄膜。通過調節電解液的種類及濃度、溫度、氧化時間及氧化電壓， 可調節多孔氧化鋁通道的孔徑。它不僅能夠作為模板合成多種納米孔道陣列，也可通過修飾功能分子模擬生物體系，用于生物小分子、有機大分子、DNA和蛋白質的檢測研究[16，47，48]。Gao等[49]以陽極氧化鋁（AAO）為模板，在限域納米孔道內修飾了分散的金納米顆粒，產生“雙面神”結構環，利用該結構環可識別鏈狀DNA分子的單堿基錯配。最近，Xia的課題組利用陽極氧化鋁納米孔，通過可控的電子束蒸發技術噴鍍金和鈦，形成不同金屬修飾界面，用于區域化（孔道表面、孔道內壁、孔道表面&孔道內壁）組裝DNA功能分子，構建了一類ATP分子響應性納米孔道，通過測量跨膜離子電流和電解電流信號，系統研究了不同區域功能分子對離子門控的貢獻程度（圖3）[50]，為利用納米孔道開展跨膜離子傳輸、限閾空間電化學、生物邏輯門以及納米生物傳感器件研究提供了新思路。

2.1.4 聚合物薄膜 聚合物納米孔具有良好的生物兼容性，而且孔內表面的活性有機基團能夠作為多種分子的結合位點，極大地促進了對納米孔道功能化修飾的研究。常用的聚合物材料有聚對苯二甲酸乙二醇酯（PET）、聚碳酸酯（PC）和聚酰亞胺（PI）。徑跡刻蝕技術適于多種聚合物材質，首先利用高能重離子輻照穿透聚合物膜產生潛在徑跡，繼而采用化學刻蝕該區域得到納米孔，納米孔的幾何形貌受刻蝕條件的控制，通過改變實驗條件，可得到圓柱形、錐形和雙錐形等不同形狀的納米孔[51]。

Jiang的研究組通過調整離子轟擊強度、腐蝕液與阻蝕液的比例以及引導電流和刻蝕時間、刻蝕溫度等條件，在PET和PI等高分子材料薄膜上制備出了多種不同形貌的納米孔道[52]，并進行功能化修飾，建立了K+＼[53]、Zn2+[54]、Hg2+[55]等不同金屬離子驅動的仿生人工納米通道平臺。Ali課題組將鐵-三聯吡啶配合物共價修飾到PET納米孔道的內表面，基于乳清蛋白和金屬離子之間的特異性作用，實現了乳鐵蛋白的高靈敏、高特異性檢測（圖4）[56]，建立了一種基于金屬離子親和性的生物分子識別新方法。Liu等[57]制備了DNA超級三明治結構，并將其修飾在PET納米孔道內部，構筑了可以同時檢測目標核酸和小分子的雙檢測平臺，DNA分子的檢測限達10 fmol/L，小分子（ATP）的檢出限達1 nmol/L（圖5），能夠滿足復雜生物樣本的檢測需求。

2.2 管材料納米孔 近年來，利用管材料制備納米孔的研究發展迅速，其中玻璃毛細管憑借其化學穩定性高、加工成本低、表面容易改性等優點，備受研究者的青睞。此外，文獻也報道了一些基于碳納米管的納米孔的研究。

2.2.1 玻璃毛細管 使用激光加熱拉伸技術，可以利用玻璃毛細管加工出直徑介于幾納米到幾百納米的納米通道，通過改變加熱溫度、時間、拉力等參數能夠調控其直徑。2010年，Steinbock等[58]制備出45 nm的玻璃毛細管并首次用于檢測雙鏈DNA的折疊狀態。Chen等[59]在長鏈DNA內部的特定位置修飾鏈霉親和素，DNA分子穿過玻璃納米孔時產生特征性的電流信號，以此確定DNA內部的特定序列元件的位置。Tiwari 等[60]在玻璃納米孔內壁修飾帶負電的神經球蛋白（hNgb）， hNgb與帶正電的細胞色素c反應引起電流改變，從而研究蛋白質間的相互作用。Sze等[61]制備了直徑約16 nm的玻璃納米孔，基于λ-DNA的特殊結構引入適配體形成DNA載體探針，同時檢測人血清中3種蛋白質。

最近，Long課題組突破納米孔道的傳統概念，利用錐形玻璃納米孔進行了一系列開創性研究。將“界面動態電荷傳遞過程”限域在單獨一個納米孔道內，構建了單個“雙極電活性納米孔道界面”[62]。以納米孔道尖端限域空間為模板，將“電化學過程”限域在單個納米孔道內，通過“化學-電化學”制備的策略，構建了含有電活性尖端的無線限域納孔電極（圖6）[63]，單個無線限域納孔電極具有孔尖電荷極化增強效應，顯著提升了分析物與納米電極間的動態相互作用能力。進一步將電活性基團引入納米孔電極的尖端，有效調控電極界面極化電場，建立了納米孔電極孔尖離子流增強機制，將細胞內重要氧化還原分子的微弱法拉第電流轉化為納米孔道孔尖電荷密度的實時變化過程，獲得了極易分辨的離子流增強時序信號，從而實現了單個活細胞內電子傳遞載體還原型輔酶Ⅰ（NADH）的高選擇性、高靈敏度測量（圖7）[64]，為在單細胞水平揭示單個氧化還原代謝分子及信號分子作用機制提供了新的測量方法。

2.2.2 碳納米管 碳納米管是管狀的納米級石墨晶體，由單層或多層石墨片圍繞中心軸按一定的螺旋角卷曲而成。基于碳納米管的天然管道結構，Wu課題組[19，65]將直徑1～2 nm、長度5～10 nm的超短單壁碳納米管穩定地插入到磷脂雙層膜中，構建了一種基于超短碳納米管的新型納米孔傳感器（圖8），該傳感器具備碳納米管的獨特的物理性質，如亞原子級的平滑內表面、大π共軛體系和超疏水的內部環境等。研究人員進一步在DNA鏈上羥甲基化胞嘧啶位點修飾了一個剛性分子，利用超短碳納米管納米孔傳感器實現了對隨機序列的DNA中羥甲基化胞嘧啶位點的特異性識別。這種新型納米孔平臺集成了碳納米管的多種獨特性質，可用于單分子檢測、DNA 損傷檢測、納米孔DNA 測序等領域。

3 展 望

固體納米孔分析技術已廣泛應用于DNA測序和生物傳感分析，應用領域不斷拓寬。然而， 目前納米孔技術仍然主要用于體外檢測，將其用于細胞內分析的研究剛剛開始。 隨著孔道材料的迅速發展以及相關儀器的不斷改進，固體納米孔將在細胞分析甚至活體檢測領域發揮重要的作用，不僅能夠推動基礎研究的發展，還可望用于重大疾病診斷及個性化醫療等領域。

此外，將納米孔電化學技術與非電流的傳感技術如光譜法相結合，可同時獲得電化學和光譜信號，納米孔能夠實時提供分析物的結構信息，光學信號可以揭示待測物的化學性質，為納米孔檢測提供強有力的信息支持。目前已有研究者開展了固體納米孔結合暗場顯微成像的研究工作，相信在未來的研究中，更多的光譜技術會進入該領域，以構建更加完整的單分子光電檢測平臺，獲得多重單分子行為信息，從而實現待測物的實時、動態、原位分析研究。

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Abstract Nanopore technique is a low-cost tool for single-molecule level analysis without the need of label or amplification. The solid nanopores have been widely used in many fields such as chemistry and life sciences due to their advantages such as high stability， good tolerability， controllable size， and easy for modification. The solid nanopores commonly used in recent years are fabricated using two types of materials： membrane and tube. The membrane materials include silicon nitride， two-dimensional materials， aluminium oxide， and polymer membranes. The tube materials mainly include glass capillary and carbon nanotube. This review summarizes and prospects the research progress of different solid nanopores.

Keywords Solid nanopore； Single-molecule analysis； DNA sequencing； Review

（Received 31 March 2018； accepted 14 May 2018）