關節軟骨的紅外光譜成像及支持向量機定量研究

翟明陽 趙遠 高浩尚 林偉 徐浩 尹建華

摘 要 傅里葉變換紅外光譜成像（FTIRSI）技術可同時獲得樣本組織的顯微結構信息和紅外光譜信息，結合化學計量學算法可用于樣品光譜信息的定量分析和組織判別的研究。基于此，本實驗采用FTIRSI技術結合支持向量機分類（SVC），實現健康和病變關節軟骨組織的判別，其識別率分別為100.0%和95.4%，準確率達到97.7%； 基于FTIRSI建立支持向量回歸（SVR）模型定量研究關節軟骨樣本中膠原蛋白和蛋白多糖兩種生物大分子的含量與分布，發現病變關節軟骨中蛋白多糖的含量發生流失，尤其在表層區。研究結果表明，FTIRSI與支持向量機（SVM）相結合有望成為一種新型的骨關節炎診斷工具，對骨關節炎監測和診斷研究具有重要意義。

關鍵詞 關節軟骨； 骨關節炎； 傅里葉變換紅外光譜成像； 支持向量機； 蛋白多糖； 膠原蛋白

1 引 言

關節軟骨是維持關節正常生理功能的重要組織之一，在關節運動時可與其周圍組織（滑液、韌帶以及骨小梁等）精確地相互作用，使關節的磨損度降到最小。健康關節軟骨組織主要由軟骨細胞和細胞外基質構成，表面光滑且有一定的彈性。細胞外基質的主要成分有膠原蛋白（Ⅱ型膠原）、蛋白多糖、水和無機鹽，此外還有結構糖蛋白及少量脂肪等[1]。膠原蛋白和蛋白多糖作為基質的兩種主要成分，膠原蛋白纖維排列成網絡結構以維持軟骨的結構和形狀[2]，蛋白多糖包埋于膠原纖維網絡中，具有一定的抗壓和分散負荷的能力[3]。關節軟骨具有明顯的板層狀結構，大多分為表層區（Superficial zone， SZ）、過渡區（Transitional zone， TZ）、放射區（Radial zone， RZ）和鈣化區（Calcified zone， CZ）。值得注意的是，不同區域的膠原蛋白和蛋白多糖的濃度、分布以及結構不同[4]。

若膠原纖維網絡破壞或者蛋白多糖缺失，關節軟骨的組織功能便開始退化，最終會導致骨關節炎（Osteoarthritis， OA）等關節疾病的發生。目前大多數OA患者表現出明顯的臨床癥狀時已經處于OA的中后期，難以進行有效的治療，而OA早期的癥狀不明顯，僅表現為軟骨基質主成分濃度及細胞形態和活性的改變[5]。因此，采用常規的臨床手段和實驗手段[6～10]很難進行OA的早期診斷。

傅里葉變換紅外光譜成像（Fourier transform infrared spectroscopic imaging， FTIRSI）技術將傅里葉變換紅外光譜測量和微區成像技術有機結合起來，可同時采集樣品的分子光譜和表面形貌信息，具有高精度、高靈敏度以及高空間分辨率等優點[11，12]。支持向量機（Support vector machine， SVM）由Vapnik等在1995年首次提出，是基于統計學習理論發展起來的一種模式識別方法，通過非線性映射將數據樣本映射到高維特征空間，以尋求最小化結構風險，從而在這個空間獲得良好的線性分類或回歸結果[13]。從某種意義上講，支持向量機分類（Support vector machine classification， SVC）和支持向量回歸（Support vector regression， SVR）的本質是相同的。SVC是通過尋找最優分類超平面，讓兩個分類集合的支持向量或者所有的數據離分類平面最遠； SVR是通過尋找最優回歸平面，讓一個集合的所有數據到該平面的距離最近。SVM相較于其它傳統方法，它的分類和回歸能力在解決小樣本數、非線性以及高維數據空間等問題上有其獨特的優勢[14，15]。首先，通過尋求最小化結構風險，提高了回歸模型的泛化能力，經驗風險和置信范圍最小化也因此得以實現，進而可以使小樣本訓練集有良好的回歸預測結果； 其次，該算法可以轉換成一個凸優化（二次規劃）問題，理論上，得到的將是全局最優解，它通過引入核函數，既解決了樣本分類過程中線性不可分問題，也解決了高維空間中的“維數災難”等問題，從而避免了過擬合問題[16，17]。目前常用的核函數類型主要有以下4類：線性核函數（Linear kernel function， LF）、采用多項式形式的內積核函數（Polynomial kernel function， PF）、徑向基核函數（Radial basis kernel function， RBF）以及Sigmoid核函數。支持向量機性能的優劣主要取決于核函數及其參數的選擇，其中核函數的選擇更為重要[18]，但沒有一種公式化的方法進行二者的選擇，通常采用不斷嘗試的方式確定最優參數。

紅外光譜技術結合SVM算法在諸多領域已得到廣泛應用[19，20]。Cheng等[19]通過基于小波特征提取的傅里葉變換紅外光譜和支持向量機相結合，將正常、發育異常、早期癌變以及晚期癌變進行分類，實現早期結腸癌的診斷檢測。張錄達等[20]用小麥樣品蛋白質含量與其近紅外光譜建立SVR模型，以此預測小麥樣品中蛋白質的含量，預測結果與凱氏定氮法確定的結果平均誤差小于0.32，并與偏最小二乘（PLS）回歸模型的預測結果進行對比，表明所建SVR模型可與近紅外光譜相結合用于實際樣品的定量分析，且有較好的分析效果。本研究將傅里葉變換紅外光譜技術與SVM算法相結合用于OA的研究，首先（SVC）對健康和2年病變的關節軟骨樣本進行判別分類研究，進而（SVR）研究兩種主成分在兩種樣本中的定量分布和含量變化，為軟骨的退化和修復過程研究提供實驗依據。本方法有助于發展新型的OA診斷工具。

圖2是健康和2年病變關節軟骨組織的可見光圖像，全吸收圖像以及AmideⅡ、糖帶的特征吸收圖像。通過觀察健康關節軟骨AmideⅡ（圖2C）以及糖帶（圖2D）的特征吸收圖像，發現從軟骨表層區到軟骨下組織，膠原蛋白的含量分布不均勻，表層區高于深層區，而蛋白多糖恰相反，表層區含量明顯少于深層區。根據以上的定性分析可知，關節軟骨組織中膠原蛋白和蛋白多糖的含量隨組織徑向深度的增加呈不同的含量分布。

將健康和病變關節軟骨的紅外光譜圖像進行對比分析發現，OA關節軟骨組織中軟骨細胞的數量減少，大小和形態也發生了變化，已不能將軟骨細胞與周圍物質明顯區分（圖2A）； OA關節軟骨在表層區和過渡區吸光強度減弱，說明此區域組織內生物大分子物質含量可能有損失（圖2B）。OA關節軟骨的膠原蛋白含量在表層區和過渡區出現少量丟失，深層區基本沒變（圖2C），膠原蛋白含量的損失則可能代表OA的發生時間較長[24]，而蛋白多糖在表層區和過渡區出現了明顯的丟失，深層區相對較弱（圖2D）。客觀上，紅外吸收圖像中的吸光度代表同一樣本成分含量的相對變化，不能表示不同樣本之間的絕對含量差異。因此，對健康和病變關節軟骨進行定量判斷與預測，需要借助化學計量學算法進行分析。

3.2 SVC模型的評估和預測

通過不同核函數（LF，RBF，2nd-PF和3rd-PF）及其相應參數的不斷嘗試，幾組較優SVC模型對預測集的準確率如表1所示，核函數及其參數的選擇會影響SVC模型預測能力。通過對比預測集的結果，SVC模型的構建最終選用徑向基核函數，參數C=1，且G=10。

SVC預測集的結果如表2所示，健康組全部被正確識別； 對于OA-2Y組，3個光譜被誤判到健康組，即來自于切片OA-2Y-2sec的最后3組光譜。兩組最終預測鑒別準確率為97.69%。出現誤判的原因可能是：其一，該軟骨組織切片較其它切片OA病變程度輕，蛋白多糖含量丟失主要發生在SZ，而TZ及更深區域含量變化較小，因而造成誤判[25]； 其二，因OA軟骨細胞形態、大小等發生變化[26]，可能會帶來更強的光散射效應，這也會對判別

結果造成影響。

前期的研究工作中，采用FTIRSI結合各種化學計量學算法來識別軟骨的退化程度[21，27]，其中，偏最小二乘判別分析（PLS-DA）和主成分分析-Fisher判別分析（PCA-FDA）的鑒別準確率分別為90.2%和86.7%，相比之下，SVC模型具有極高的判別準確率。最重要的是，SVC可以通過使用特定的核函數，克服了關節軟骨變性期間其非線性變化和不明顯的界限，更適合于不同類型的樣本分布。但是該方法有其局限性，首先，核函數及其參數的確定是非常耗時的，通常，核函數和參數的優化組合取決于樣本的類型，需要在不斷嘗試之后確定； 其次，SVC的結果輸出是分類值而不是得分（如PCA-FDA或PLS-DA），分類值不能反映組內每個光譜的分布情況及其退化程度，因此難以確定不同組的譜圖差異，也難以進行有效的統計分析。

3.3 SVR模型的評估和預測

SVR模型中采用的預處理組合是最大值標準化（Maximum normalization）+擴展多元散射校正（Extended multi-scatter calibration， EMSC），選用線性核函數： ε=0.1， C=0.0005。SVR模型性能的優劣可以通過均方根誤差（Root mean square error， RMSE）和擬合優度（R-Square）兩個參數進行評估。OA-2Y模型校正集和驗證集的RMSE和R-Square見表3。其中，RMSE代表樣本相對于回歸線的離散程度，其值越小說明離散程度小； R-Square代表擬合優度或相關系數的平方，其值越大，越接近1， 說明兩個集合相關程度高。由此可知，預測值與真實值二者的相關性很強，所建SVR模型具有良好的預測能力。然而，SVR存在過擬合的問題，以上兩個參數的評估僅做參考，而最終模型好壞的確定，還需要依據模型預測未知樣本的結果，并不斷調整相關參數以達到最理想的效果。

圖3為SVR模型計算的病變關節軟骨組織中膠原蛋白和蛋白多糖的分布情況和PLS模型結果[28]的比較。發現SVR計算得到的OA關節軟骨膠原蛋白的平均濃度（67.6%）遠高于蛋白多糖的平均濃度（32.4%），并且與PLS計算的結果接近（膠原蛋白和蛋白多糖的平均濃度分別為70.7%和31.9%），兩種方法對膠原蛋白和蛋白多糖的預測結果分別僅相差3.05%和0.52%。此結果與文獻[22，28]報道基本一致，并且兩種生物大分子的分布情況與其特征吸收圖像的定性分析基本吻合（圖2C和2D），驗證了SVR模型對病變樣本較好的預測能力。

關節軟骨中主成分含量隨組織深度變化明顯。與健康樣本預測結果對比發現[22，28]，在2年病變關節軟骨中，蛋白多糖含量在表層區、過渡區以及深層區末端丟失比較嚴重，在深層區中部含量基本不變。蛋白多糖的損失發生在軟骨表面下200 μm深度之前，這足以引起軟骨表面纖維化及其功能變性，影響患者的正常活動。深層區末端蛋白多糖濃度的減弱則可能與OA期間深層區的部分鈣化有關，鈣化作用及軟骨細胞功能退化造成了蛋白多糖的生成減少[29]。

4 結 論

采用FTIRSI技術對犬膝關節軟骨組織切片進行紅外光譜成像，與化學計量學方法SVM相結合，成功應用于關節軟骨組織的判別分析及其主成分（膠原蛋白和蛋白多糖）含量分布的研究。FTIRSI-SVC用于健康和病變關節軟骨的判別，其預測鑒別準確率達97.7%，優于PCA-FDA以及PLS-DA結果，為OA的早期臨床診斷及相關研究提供了一種方便可靠的方法，此外，因其使用特定的核函數，可應用于多組樣本數據的分類識別； FTIRSI-SVR用于定量分析關節軟骨中膠原蛋白和蛋白多糖的含量分布，一定程度揭示了病變過程中生物大分子含量的變化規律，有助于監測關節疾病進展及組織損傷和修復。

致 謝： 感謝美國奧克蘭大學Xia Yang教授課題組所提供的研究支持。

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Abstract Fourier transform infrared spectroscopic imaging （FTIRSI） technology can simultaneously obtain microstructure information and infrared spectral information of the samples. The method of FTIRSI combined with chemometric algorithms can be used for quantitative analysis of sample spectral information and tissue discrimination research. Based on this， FTIRSI and support vector machine classification （SVC） for the first time were used in this work to discriminate healthy and degenerated articular cartilage， with high accuracies of 100% and 95.4%， respectively， and sum accuracy of 97.7%. The support vector regression （SVR） model was used to quantitatively study the contents and distribution of two biomacromolecules， collagen and proteoglycan， in articular cartilage. The proteoglycan loss occurred in the degenerated articular cartilage， especially in the superficial area. This study indicates that the combination of FTIRSI and support vector machine （SVM） is expected to become a new diagnostic tool for osteoarthritis， which is of great significance for the early diagnosis and research of osteoarthritis.

Keywords Articular cartilage； Osteoarthritis； Fourier transform infrared spectroscopic imaging； Support vector machine； Proteoglycan； Collagen

（Received 8 January 2018； accepted 24 March 2018）