食鹽對小鼠腸道微生物、酶活及血常規的影響

朱佳源 鄭 淘 肖嫩群 羅懷浩 龔 郡 包思慧

(1. 湖南中醫藥大學湘杏學院，湖南 長沙 410208；2. 湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410208)

鈉的來源廣泛，食鹽是鈉攝入的主要來源。但食鹽攝入過高或過低，都不利于身體健康。研究表明，食鹽的攝入量與高血壓發生率呈正比，低食鹽攝入可以有效防治高血壓，明顯降低其引發的相關疾病[1]；長期過量攝入食鹽可能導致糖尿病、中風及冠心病等的發生[2]，還可能誘發哮喘、胃癌、前列腺增生以及骨質疏松[3-4]；而食鹽用量過低，可能發生低鈉綜合征，情況嚴重的還會心臟衰竭而死亡[5]。

動物腸道中含有大量微生物。研究[6]表明，腸道菌群可以稱作人體的“第二基因組”“第二大腦”或“微生物器官”，其群落結構在人體的許多生理功能上發揮重要作用，如機體能量吸收、物質代謝、胃腸道功能的完善及免疫功能的調節等。人體的許多疾病均與腸道微生物的群落結構失衡有關，如肥胖、糖尿病、心腦血管疾病、胃腸道癌癥、炎癥性腸炎(IBD)、腸易激綜合征(IBS)、自身免疫性疾病以及自閉癥、抑郁癥、老年癡呆等精神性疾病等。腸道微生物與宿主的共生關系與人體的健康有著千絲萬縷的關系。哺乳動物體內的酶可參與宿主糖類、氨基酸、脂質等營養物質的代謝，在機體營養物質吸收、生理機能完善、提供能源物質等方面具有重要意義[7-8]。至今，沒有食鹽對腸道微生物影響的相關報道，研究食鹽對腸道微生物的影響，有助于揭示食鹽對機體健康影響及其機制。

血常規檢查是臨床上最基礎的化驗檢查之一，主要包括紅細胞系統、白細胞系統和血小板系統，它對全身性疾病的早期跡象、貧血、血液系統疾病等診斷具有重要意義。紅細胞、血紅蛋白、紅細胞比容下降提示貧血的存在，增加則可能存在紅細胞增多癥。白細胞增高疑有炎癥，多為細菌感染。血小板降低有出血傾向，增高則容易形成血栓[9]。這類指標對于人們膳食的營養學評價具有重要作用。

本試驗擬對食鹽攝入量影響腸道微生物、酶活性及血常規的特征進行研究，以期為人們合理膳食用鹽提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

30只昆明小鼠(Kunming mice，KM小鼠)：SPF級，雌雄各半，體質量(20±2) g，湖南斯萊克斯動物實驗有限公司；

飼料：玉米30%、麩皮26%、豆餅29%、食鹽1%、骨粉1%、賴氨酸1%、水12%，根據以上配比粉碎后制粒，湖南中醫藥大學實驗動物中心；

細菌：牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基；

大腸桿菌：伊紅美藍瓊脂培養基(EMB)；

乳酸菌：乳酸細菌瓊脂培養基(MRS)；

雙歧桿菌：雙歧桿菌選擇性瓊脂培養基(BBL)。

1.2 方法

1.2.1 試驗動物分組 小鼠在適宜的環境下(相對濕度50%～70%，室溫23～25 ℃，清潔安靜)適應性喂養2 d后，隨機分為A、B、C、D、E 5組，每組6只，雌雄各半。

1.2.2 食鹽給量 根據《中國居民膳食指南》人均每日食鹽攝入推薦量6 g[10]，A～E組分別設置0，3，6，9，12 g梯度鹽量，依次換算成小鼠食鹽量0.00，0.16，0.32，0.48，0.64 mg/(g·d)。將食鹽配成相應濃度后進行灌胃，2次/d，每次0.4 mL，期間間隔8 h。

1.2.3 血樣的采取及檢測 眼球采血。根據要求，取樣前禁食12 h，禁水1 h，每只1.5～2.0 mL，在EDTA-K2抗凝管中輕輕混勻，2 h內送湖南中醫藥大學第一附屬醫院檢驗科進行血常規檢測。

1.2.4 腸道內容物的采集 小鼠處死后放于超凈工作臺上，無菌操作采集小鼠空腸到回腸段的腸道內容物，同組混勻備用。

1.2.5 腸道微生物數量的分析 根據文獻[11]，無菌操作稱取腸道內容物至裝有玻璃珠及無菌水的三角瓶中，120 r/min 振搖30 min后，十倍稀釋法進行稀釋，涂抹法接種培養。細菌和大腸桿菌在37 ℃培養24 h進行計數，乳酸菌和雙歧桿菌在37 ℃厭氧培養箱中培養48 h進行計數，3次重復，換算成每克腸道內容物的菌數。

1.2.6 腸道酶活性的測定 用無菌水稀釋腸道內容物后，在40 ℃水浴保溫30 min，充分溶出酶蛋白，2 000 r/min離心10 min，上清液用于酶活性的分析。采用DNS比色法測定木聚糖酶、纖維素酶和淀粉酶的活性，福林-酚法測定蛋白酶的活性[12]。用1 g腸道內容物50 ℃、30 min生成1 μg還原糖分別定義為一個纖維素酶活單位(U)和木聚糖酶活單位(U)；1 g腸道內容物在40 ℃、30 min生成1 μg還原糖定義為一個淀粉酶活單位(U)；1 g腸道內容物在37 ℃、30 min生成1 μg氨基酸定義為一個蛋白酶活單位(U)。

1.2.7 數據的處理方法 用SPSS 21.00軟件處理數據，采用單因素方差分析判斷各組均數間的差異，兩組間均數差異比較用獨立樣本t檢驗，各組的數據采用平均值±標準差(x±s)表示，P<0.05有顯著性差異，P<0.01有極顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 食鹽量對小鼠腸道微生物的影響

由表1可知，食鹽量最高的E組乳酸菌數、細菌總數、雙歧桿菌數和大腸桿菌數均為最高，與對照組比較具有顯著的統計學意義(P<0.01)。C組與A組比較，乳酸菌數和雙岐桿菌數沒有差異性，細菌總數卻下降明顯(P<0.01)，而大腸桿菌數顯著增加(P<0.01)。B組的乳酸菌數和細菌總數與A組比較沒有統計學意義，而雙岐桿菌和大腸桿菌數增加顯著(P<0.01)。日服用3 g食鹽的小鼠腸道雙歧桿菌數顯著增加，乳酸菌數和細菌總數與空白組沒有差異；而日服用12 g 食鹽的小鼠腸道乳酸菌數、細菌總數、雙岐桿菌數和大腸桿菌數均遠遠高于空白組。說明日服用適當的食鹽能夠促進雙歧桿菌等益生菌的生長來促進和維護機體健康，而長期高鹽攝入可能使腸道菌群失調，可能引起心腦血管相關疾病。總體來看，食鹽對大腸桿菌的影響最明顯，均能促進腸道大腸桿菌的生長，可能是為其生長繁殖提供了某種促進因子。

2.2 食鹽量對小鼠腸道酶活性的影響

由表2可知，食鹽攝入對小鼠腸道蛋白酶活性具有抑制作用，其中B組活性降低最小，與A組最接近。淀粉酶方面，B、C組與A組比較酶活性下降，B組降低較少，與A組接近，而D、E組酶活性高于A組，其中食鹽量最高的E組淀粉酶活性最高。另外B組小鼠的腸道木聚糖酶活性、纖維素酶活性也顯著提高(P<0.01或P<0.05)。試驗可知，食鹽量越高，小鼠淀粉酶活性越高，日服用12 g食鹽，淀粉酶活性最高，且遠遠高于空白對照組，說明高鹽膳食是糖尿病發生的一個潛在因素。日服用3 g食鹽，淀粉酶活性有所降低，但與空白組活性最接近，且木聚糖酶、纖維素酶活性顯著增加，這有利于小鼠營養物質吸收，改善腸道健康，提高動物的非特異性免疫能力，從而提高小鼠的健康水平[13]。合理膳食用鹽，有利于腸道酶活性的調節，減少糖尿病發生的幾率，維護機體代謝和人體健康。

2.3 食鹽量對小鼠血小板的影響

血小板在機體參與止血與血栓形成中起重要作用。由表3可知，B、C、D、E組分別與A組比較，在血小板平均體積(Mean platelet volume,MPV)、血小板體積分布寬度(Platelet volume distribution width,PDW)方面有顯著差異(P<0.01或P<0.05)，但B、C、D、E各組間比較沒有差異性(P>0.05)。B組小鼠的血小板計數為各組中最高，對提高小鼠凝血功能具有重要意義。日服用3 g食鹽，小鼠的血小板數量最高，可能與小鼠食鹽后脾亢有關。

2.4 食鹽量對小鼠紅細胞的影響

由表4可知，B、C、D、E組分別與A組比較，在紅細胞計數、紅細胞比容、紅細胞平均體積和紅細胞分布寬度方面沒有任何統計學差異(P>0.05)，說明膳食用鹽不會影響機體貧血。

2.5 食鹽量對小鼠血紅蛋白的影響

由表5可知，B組與A組小鼠的血紅蛋白及紅細胞平均血紅蛋白含量接近，但B組小鼠的紅細胞平均血紅蛋白濃度最高。C組的紅細胞平均血紅蛋白濃度分別與B組和D組比較下降明顯(P<0.05)。

2.6 食鹽量對小鼠白細胞的影響

由圖1可知，B組小鼠的白細胞數和淋巴細胞數含量最高。C組與A、B組比較白細胞數量和淋巴細胞數量顯著降低(P<0.01或P<0.05)。日服用6，9，12 g食鹽，小鼠的白細胞數、淋巴細胞數均低于空白組和日服用3 g食鹽組。有研究[13]表明，高鹽飲食者易患感冒，是因為高濃度食鹽能抑制呼吸道細胞活性，使機體抗病能力下降；同時還減少唾液及口腔溶菌酶，增加病毒和病菌感染呼吸道的機會，可能與高鹽飲食降低血液中白細胞數和淋巴數量有關。

表1 食鹽量對小鼠腸道微生物的影響?Table 1 Effect of salt doses on mice intestinal microbes (n=6)

? 同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)；不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。

表2 食鹽量對小鼠腸道酶活性的影響?Table 2 Effect of salt doses on mice intestinal enzyme activities (n=6) U/g

? 同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)；不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。

表3 食鹽量對小鼠血小板的影響?Table 3 Effect of salt doses on mice platelet (n=6)

? 同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)；不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。

表4 食鹽量對小鼠紅細胞的影響?Table 4 Effect of salt doses on mice red blood cell (n=6)

? 同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)；不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。

表5 食鹽量對小鼠血紅蛋白的影響?Table 5 Effect of salt doses on mice hemoglobin (n=6)

? 同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)；不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。

*. P<0.05 **. P<0.01 圖1 食鹽量對小鼠白細胞的影響Figure 1 Effect of salt doses on mice white blood cell (n=6)

3 結論

膳食用鹽可能通過影響腸道菌群平衡，引起機體血壓等心腦血管疾病的發生；食鹽改變腸道酶活性，引起機體代謝變化，可能是糖尿病發生的一個因素；高鹽攝入不利于身體健康，可能降低機體免疫功能，增加機體患病的風險。綜合分析腸道微生物、腸道酶活以及血常規各項數據，建議成人每天按3 g食鹽標準食用較好。

微生物培養法不能全面知曉腸道中的微生物特征，只能對在所用培養基和培養條件下生長的微生物進行認知，隨著分子生態學技術的發展，進一步運用新的生物學研究技術，探討食鹽影響機體健康的關鍵菌群，將更加有利于指導合理膳食用鹽。運用代謝組學等方法探討膳食用鹽對腸道菌群的影響，將更加有利于研究食鹽對機體代謝性疾病影響的機制。