MTT法檢測夏枯消瘤丸含藥血清對人肺癌A549細胞的實驗研究

王素娟，王 愷，侯燕琳

（山西省中西醫結合醫院，山西太原030013）

本研究以探尋中醫藥治療肺癌的高效低毒途徑為出發點，探討夏枯消瘤丸含藥血清對人非小細胞肺癌A549的干預，采用MTT法檢測人肺癌A549細胞的增殖，探討夏枯消瘤丸含藥血清對人肺癌A549細胞的細胞毒作用，從而明確夏枯消瘤丸對腫瘤的抑制作用。觀察不同組別及含藥血清濃度組對人肺癌A549細胞的細胞形態及生長狀態的影響，從而探究其抑制腫瘤生長的有效濃度及劑量。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 清潔級SD大鼠，35只，體質量250～300 g，雌雄各半，購自山西醫科大學實驗動物中心［許可證號：scxk（晉）2009-0001］。飼養溫度23℃左右，相對濕度（60±10）%。

1.1.2 實驗藥物 夏枯消瘤丸：江陰天江藥業有限公司生產顆粒劑。順鉑：貴州漢方制藥有限公司，批號：國藥準字H20020272。

1.1.3 細胞株 高轉移人巨細胞肺癌細胞系A549細胞株，購自山東省醫學科學院細胞室。

1.1.4 藥物與試劑 RPMI1640培養液：賽默飛世爾生物化學制品（北京）有限公司，規格：500 mL/瓶，批號：NVE0268；胎牛血清（FBS），杭州四季青生物工程材料有限公司，批號：150701；0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液，原產Amresco，北京Solarbio灌裝；L-谷氨酸胺，原產Amresco，北京Solarbio灌裝；青霉素、鏈霉素，華北制藥有限公司；噻唑蘭（MTT），北京Solarbio科技生物公司，規格：250 mg/瓶，批號：M8180；二甲基亞砜（DMSO），武漢博士德生物工程有限公司；臺盼藍：廣州威佳生物有限公司，使用前用PBS緩沖液配成1%溶液。

1.1.5 實驗儀器 CO2培養箱（BB5060UV 型）、鼓風干燥箱（熱空氣Sut6型）、超純水系統（sgavplus型），均為德國Heraeus公司產品超凈工作臺，ClassⅡ2085型，美國Thermo Forma公司；低速自動平衡離心機，DT5-3型，北京時代北利離心機有限公司；電子分析天平：ME235P，北京賽多利斯儀器系統有限公司；電熱恒溫水浴箱，SGSY2-11型，北京醫療設備有限責任公司；電熱壓力蒸汽消毒器，YXQG02型，山東安得醫療科技有限公司；倒置相差顯微鏡，1X50S8F型，日本 Olympus公司；自動酶標記數儀，2010型，鄭州博賽生物工程有限責任公司；可調式移液器，Thermo型，熱電（上海）儀器有限公司；細胞計數板，上海求精生化試劑儀器有限公司；凝膠成像分析系統，美國Alpha公司，型號 2200；細胞培養瓶（25cm）、凍存管，均為美國 Corning公司產品；細胞培養板（6孔、96孔）、一次性無菌過濾器（0.22 μm），均為美國 Costar公司產品；扭力天平，上海第二天平儀器廠，TN型。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養 高轉移人肺癌A549細胞 2×105/mL接種于含15%胎牛血清和含1%的青霉素、鏈霉素RPMI1640完全培養液中，置于37℃、5%CO2飽和濕度的CO2培養箱中培養，細胞貼壁生長，隔日傳代1次。傳代后接種于培養瓶中，每瓶細胞數1×105/mL。細胞生長至3 d左右，在倒置相差顯微鏡下觀察，如細胞長滿貼壁，即可傳代。在無菌操作臺中操作，用吸管吸去培養瓶中舊的培養液，并換用新的無菌吸管吸取0.25%胰蛋白酶液2 mL，當細胞間隙變大，細胞形態變圓時取新吸管小心吸棄胰蛋白酶液，加入2～3 mL PBS液，輕輕轉動培養瓶，小心吸棄PBS液。加入培養液后用吸管吸取培養液輕輕吹打瓶壁細胞，使其脫離瓶壁形成單細胞懸液。用細胞計數板在顯微鏡下計數，取實驗所需細胞數分裝入新培養瓶，添加培養液或各實驗用藥適量，置于37℃、5%CO2飽和濕度的CO2細胞培養箱中進行無菌培養，隔天傳代1次，實驗時取對數生長期細胞。

1.2.2 含藥血清的制備 取雄性SD大鼠 35只，體質量250～300 g，隨機分為正常對照組10只，含藥血清制備組25只，含藥血清組給予夏枯消瘤丸4 mL/次，2次/d灌胃，正常對照組每日給予等量生理鹽水灌胃，于給藥第3天最后1次灌藥1 h后，戊巴比妥鈉麻醉，10 min后腹主動脈及心室采血，無菌分離血清，經56℃，30 min滅活處理，用0.22 μm的微孔濾膜過濾除菌后分裝入小瓶，置于-20℃冰箱中保存備用。

1.2.3 細胞懸液的制備及分組 取對數期生長的人肺癌 A549細胞，經0.25%胰酶消化后加入含10%胎牛血清的RPMI1640完全培養液，接種于培養瓶中，貼壁后置37℃、5%CO2飽和濕度的CO2培養箱中培養24 h。細胞生長旺盛并貼壁后，去掉原培養液，分別加入各組不同濃度的含藥血清或含有DDP的培養液于培養箱中繼續培養24 h，經0.25%胰酶消化后收集細胞并調整細胞至需要的濃度。分組如下：正常對照組：10%胎牛血清；夏枯消瘤丸不同劑量組：5%含藥血清組、10%含藥血清組、20%含藥血清組；陽性對照組：DDP組；聯合治療組：DDP組+5%含藥血清組、DDP組+10%含藥血清組、DDP組+20%含藥血清組。

1.2.4 MTT配制 避光條件下，配制濃度為5 mg/mL的MTT溶液，磁力攪拌器攪拌30 min，使MTT充分溶解。經一次性0.22 μm無菌濾器過濾后直接分裝于 EP 管中，1.5 mL/管，鋁箔包裹，-20 ℃保存，臨用前4℃解凍。

1.2.5 指標檢測

1.2.5 .1 MTT法檢測細胞增殖 測定細胞抑制率可以反映藥物對細胞增殖的影響。對數增長期的人肺癌A549細胞經胰酶消化后，用計數板細胞計數，以 200 μL/孔（每孔細胞數為 2×104）接種于 96 孔平底培養板中，每組設8個復孔，共分6組，右下方剩余孔作為調零孔組，不加細胞僅加入 1640培養液200 μL，余則加細胞懸液。各組接種細胞后置于 37℃、5%CO2飽和濕度的 CO2培養箱中無菌培養，培養 24 h，至細胞生長旺盛貼壁后，去掉原培養液，換成以上分組實驗用藥，加樣后分別繼續培養24 h、48 h，于實驗結束前4 h吸去上清，加入5 g/L MTT 20 mL，37℃孵育4 h，吸盡上清，加入100 μL二甲基亞砜振蕩10 min，沉淀溶解完全后用自動酶標比色儀在波長490 nm處讀取吸光值（A490）。

1.2.5 .2 觀察人肺癌 A549細胞細胞形態及生長狀態 經上述處理的各組細胞培養 24 h后，去除原培養液，用 PBS 2 mL輕輕清洗 2次；以甲醇∶醋酸（3∶1），每孔加 2 mL，固定 30 min；Giemsa染液與 PBS以 1∶9混合成工作液（現用現配），濾紙過濾后染色10～30 min，自來水沖凈多余染液，至背景干凈為止，晾干后于倒置相差顯微鏡下觀察。

1.3 統計學方法

2 結 果

2.1 夏枯消瘤丸含藥血清對人肺癌A549細胞增殖的影響

結果見表1。

2.2 肺癌A549細胞細胞形態及生長狀態

正常對照組的人肺癌 A549細胞培養 24 h后在鏡下見其貼壁生長旺盛，鄰近細胞生長融合成片，胞漿飽滿，細胞輪廓清晰，細胞外型呈梭形或多角形，鋪展良好；加用含藥血清后的人肺癌A549細胞，24 h后觀察可見細胞漸變圓突起，細胞間連接松弛，增殖速度變慢，逐漸由貼壁而脫落，且隨濃度的增加而脫落更明顯，脫落細胞懸浮于培養液中，細胞形態變圓或形態不規則，細胞中顆粒增多，部分細胞胞膜尚完整，顏色加深，折光性增強，部分細胞結構不完整，細胞碎裂。結果顯示：從形態學上直接觀察細胞生長狀態，各含藥血清組均可破壞人肺癌A549細胞的正常形態，阻礙其增殖生長；含藥血清對人肺癌A549細胞的增殖抑制作用與含藥血清的濃度呈正相關，與DDP聯合用藥有協同作用。倒置相差顯微鏡高倍鏡下可見正常對照組人肺癌 A549細胞胞漿飽滿，細胞輪廓清晰，細胞外型呈多角形，鋪展良好，細胞生長旺盛，相鄰細胞生長暈融合成片；5%、10%、15%含藥血清組、DDP組、10%含藥血清+DDP組可見部分細胞膜皺縮，細胞核染色質濃集，核固縮，細胞胞漿內有空泡變性，核碎裂，即出現凋亡細胞；并可見凋亡細胞隨含藥血清濃度增高而增多。24 h鏡下觀察顯示隨含藥血清濃度增高，凋亡細胞增多，細胞形態改變明顯。

3 討 論

肺癌是惡性腫瘤死亡的首要原因，約占全世界所有癌癥死亡人數的1/3。近年來，世界上很多國家的肺癌發病率和死亡率呈急劇上升趨勢。2002年全世界的肺癌新病例大約為135萬，死亡118萬，居惡性腫瘤第1位［1］。根據我國居民死因調查的結果，肺癌死亡率從20世紀70年代中期至90年代初期的20年增加近1.5倍，是增長最快的惡性腫瘤［2］。肺癌作為惡性腫瘤死亡的首要原因，其中非小細胞肺癌（non-smallcelllung cancer，NSCLC）在肺癌中約占80%～90%，嚴重威脅人類健康。目前治療多數是以手術、化療、放療為主，常用抗腫瘤藥物的臨床療效有限，且抗瘤藥物的諸多毒副作用如骨髓抑制、消化道反應等會嚴重影響腫瘤患者對化療的耐受性和依從性。因此，尋找高效低毒的治療藥物成為近年來腫瘤基礎和臨床研究的熱點。

表1 夏枯消瘤丸含藥血清對人肺癌A549細胞增殖的影響 （±s）

表1 夏枯消瘤丸含藥血清對人肺癌A549細胞增殖的影響 （±s）

注：與 10%正常對照組比較，1）P＜0.05

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本研究以探尋中醫藥治療肺癌的高效低毒途徑為出發點，探討夏枯消瘤丸含藥血清對人非小細胞肺癌A549的作用機制。夏枯消瘤丸源于山西名老中醫門純德先生自擬方［3］。藥物組成：夏枯草 150 g，生白芍 10 g，元參 15 g，川貝母 15 g，三七 4 g，花蕊石 6 g，山甲珠 3 g，莪術 6 g，煅牡蠣15 g，白花蛇舌草 10 g，露蜂房 6 g，三棱 6 g，兩頭尖4 g，主要用于多類腫瘤，癥見咽干，舌紅，脈弦滑者，多以肝腎陰虧為主，肝火郁結，灼津為痰，痰火凝聚，導致氣滯血瘀，久而痰瘀互積，內結堅癖。方中以夏枯草為主清肝火，散郁結；生白芍養肝陰，緩急痛；元參、牡蠣、川貝母清熱化痰，軟堅散結；三棱、莪術、兩頭尖、山甲珠破血通絡、活血化瘀；配伍三七既有活血之用，又有止血消腫之功，使瘀血破散，而不致妄行；花蕊石、露蜂房、白花蛇舌草軟堅散結、消瘀化滯。諸藥合用，養陰清熱、活血破瘀、軟堅散結、消痰除癥。

實驗中采用的MTT比色法是一種非常經典的檢測細胞存活和生長的方法。其檢測原理為活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT（淺黃色）還原為水不溶性的藍紫色結晶甲瓚（Formazan）并沉積在細胞中，而死細胞則無此功能。二甲基亞砜（DMSO）能溶解細胞中的甲瓚，用酶標儀在490 nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活細胞數量。在一定細胞數范圍內，MTT結晶形成的量與細胞數成正比。該方法已廣泛用于很多生物活性因子的活性檢測、大規模的藥物篩選、細胞毒性試驗等，它的特點是靈敏度高、經濟。本實驗結果證明，夏枯消瘤丸含藥血清對A549細胞增殖有明顯的抑制作用，并隨著血藥濃度增大而抑制作用也隨之增強，不過效果不如DDP單用明顯。此外，夏枯消瘤丸含藥血清與DDP合用，抑制作用進一步增強，隨著作用時間延長，夏枯消瘤丸對 A549細胞增殖的抑制作用有增強趨勢，但差異無統計學意義（P＞0.05）。

本研究課題依托名老中醫經驗，經初步臨床驗證與實驗研究，證實其可靠性與有效性，結合惡性腫瘤目前的發病趨勢與死亡率，為腫瘤醫學研究提供了新的方向與靶點。