大柴胡湯中總多糖的提取工藝研究

劉曉芳，梁惠珍，葉璐霞

（山西中醫(yī)藥大學(xué)，山西太原030024）

大柴胡湯出自《傷寒雜病論》，其組成為柴胡、黃芩、芍藥、枳實(shí)、半夏、大黃、大棗、生姜。主治少陽(yáng)、陽(yáng)明合病，癥狀有往來(lái)寒熱，嘔不止，心下痞硬，胸脅苦滿(mǎn)，郁郁微煩，大便不解或協(xié)熱下利，舌苔黃，脈弦數(shù)有力［1］。現(xiàn)代研究證實(shí)該方在治療膽囊炎、膽石癥等方面有顯著療效［2］。方中含有多糖類(lèi)有效成分，近年來(lái)的研究證明，多糖的藥理作用有免疫調(diào)節(jié)、降血糖、抗腫瘤、抗衰老等，并且毒副作用小［3］。本實(shí)驗(yàn)采用正交試驗(yàn)法選擇最佳多糖提取條件，并采用苯酚-硫酸法結(jié)合紫外-可見(jiàn)分光光度法來(lái)測(cè)定大柴胡湯中的總多糖含量。

1 儀器與試藥

UV-6100S紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海元析儀器有限公司），F(xiàn)A224電子天平（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司），JA2603B電子天平（上海精科天美科學(xué)儀器有限公司），HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市杰瑞爾電器有限公司），SHB-Ⅲ 循環(huán)水

式多用真空泵（北京科偉永興儀器有限公司）。葡萄糖、濃硫酸、苯酚、95%乙醇等試劑均為分析純（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司），大柴胡湯中柴胡、大黃、黃芩、枳實(shí)、半夏、芍藥、生姜、大棗購(gòu)自山西維康堂中藥飲片有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取于105℃干燥至恒重的無(wú)水葡萄糖25.1 mg，定容于50 mL容量瓶中，搖勻后從中吸取1 mL至50 mL容量瓶中，加蒸餾水定容至刻度，搖勻即得0.100 4 mg/mL的葡萄糖對(duì)照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 按照處方精密稱(chēng)取藥材（柴胡 15 g，大黃 6 g，黃芩 9 g，芍藥 9 g，半夏 9 g，枳實(shí)9 g，大棗4枚，生姜15 g），煎煮后，依次經(jīng)紗布和棉花濾過(guò)，合并濾液，濃縮至100 mL，冷卻至室溫后加入95%乙醇使含醇量達(dá)到80%，冷藏靜置24 h，抽濾，殘?jiān)?0%乙醇洗滌2次，每次10 mL［4］，將濾餅置 55 ℃烘箱中干燥至恒重。取 0.1 g樣品，精密稱(chēng)量，置于50 mL容量瓶，加蒸餾水定容至刻度，再?gòu)闹形? mL定容于10 mL容量瓶，搖勻即得供試品溶液。

2.1.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定 精密吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液各1 mL，置于10 mL試管，加水補(bǔ)至2 mL，加入 5%苯酚（現(xiàn)配）1.0 mL，搖勻，迅速加入濃硫酸5.0 mL，搖勻后沸水浴20 min，取出放置至室溫，以相應(yīng)的試劑作為空白，在波長(zhǎng)350～700 nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描［4］對(duì)照品溶液和樣品溶液均在487 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，故確定487 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制 精密吸取對(duì)照品溶液0.1 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL，分別置于10 mL試管中，各加水補(bǔ)至2.0 mL，加入5%苯酚（現(xiàn)配）1.0 mL，搖勻，迅速加入濃硫酸 5.0 mL，搖勻后，沸水浴20 min，取出放置至室溫，以相應(yīng)的試劑作為空白，于487 nm波長(zhǎng)處分別測(cè)定吸光度為 0.133、0.330、0.441、0.563、0.703。以對(duì)照品溶液濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，見(jiàn)圖 1，得回歸方程 Y=49.752X+0.071 9（r=0.999），結(jié)果表明葡萄糖溶液濃度在 0.001 255～0.012 55 mg/mL與吸光度呈良好的線(xiàn)性關(guān)系。

2.2 最佳提取條件選擇

2.2.1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 參考文獻(xiàn)［5-6］以料液比（A）、煎煮時(shí)間（B）、煎煮次數(shù)（D）為因素，選用L（934）為正交表進(jìn)行正交試驗(yàn)，以生藥材中總多糖的含量為指標(biāo)，選取最佳提取條件。選擇因素及水平見(jiàn)表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表

2.2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果 由直觀分析結(jié)果見(jiàn)表2，影響大柴胡湯中總多糖提取率的因素從高到低依次是D、A、B，由極差可知最佳提取條件為A3B2D3。以C為誤差進(jìn)行方差分析，見(jiàn)表3，結(jié)果顯示在α=0.10時(shí)，D因素對(duì)大柴胡湯總多糖的提取有顯著性影響，A、B兩因素?zé)o顯著性影響，結(jié)合實(shí)際應(yīng)用和成本等方面考慮，選擇提取的最佳組合為A1B1D3組合。即料液比為1∶10，煎煮時(shí)間為30 min，煎煮次數(shù)為3次。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果及直觀分析表

表3 正交試驗(yàn)方差分析表

2.3 方法學(xué)考察試驗(yàn)

2.3.1 精密度試驗(yàn) 精密吸取0.5 mL葡萄糖對(duì)照品溶液6份，按2.1.3項(xiàng)下的方法測(cè)定吸光度，結(jié)果吸光 度 分別 為 0.420、0.390、0.412、0.433、0.420、0.408，RSD為3.19%（n=6），表明該方法的精密度良好。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取0.5 mL供試品溶液，按 2.1.3 項(xiàng)下的方法測(cè)定吸光度，于 15 min、30 min、45 min、60 min、90 min、120 min 進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果吸光度分別為 0.340、0.336、0.331、0.341、0.339、0.328，RSD 為 2.47%（n=6），表明供試品溶液顯色后至少在2 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取干燥樣品約0.1 g，精密稱(chēng)量，共6份，分別定容于50 mL容量瓶，再?gòu)闹形? mL定容于10 mL容量瓶，搖勻，分別精密吸取 0.5 mL 溶液，按 2.1.3 項(xiàng)下的方法測(cè)定吸光度，計(jì)算樣品中總多糖的含量。結(jié)果顯示，樣品中總多糖的含量分別為 419.80 mg/g、410.97 mg/g、412.99 mg/g、425.45 mg/g、421.50 mg/g、423.43 mg/g，平均含量為419.02 mg/g，RSD 為 1.73%，表明該法重復(fù)性良好。

2.3.4 加樣回收率試驗(yàn) 取干燥樣品 0.05 g，精密稱(chēng)量，共6份，分別加入干燥葡萄糖0.021 g，精密稱(chēng)量。加水定容于50 mL容量瓶，再?gòu)闹芯芪? mL定容于10 mL容量瓶，搖勻，分別吸取0.5 mL，按 2.1.3 項(xiàng)的方法測(cè)定吸光度，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表4，結(jié)果顯示本法平均回收率為99.74%，

RSD為3.63%，表明該法回收率較高。

表4 大柴胡湯中總多糖加樣回收率試驗(yàn)

2.4 樣品含量測(cè)定

按多糖最佳提取條件結(jié)合2.1.2項(xiàng)的制備方法平行制備3份供試品溶液，各精密吸取0.5 mL溶液，按2.1.3項(xiàng)的方法測(cè)定吸光度，含量分別為31.31 mg/g、33.07 mg/g、30.64 mg/g，得生藥材中總多糖的平均含量為31.67 mg/g。

3 討論

結(jié)合單味藥材提取多糖的方法，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，選擇出大柴胡湯中總多糖的最佳提取條件為料液比1∶10，煎煮次數(shù)3次，每次30 min。在正交試驗(yàn)中，采取原方中的十分之一藥量，節(jié)約成本，簡(jiǎn)化操作。由于抽濾后濾餅的量較少，未將其烘干至恒重，而直接加水溶解，以減少損失。

苯酚-硫酸法結(jié)合紫外-可見(jiàn)分光光度法測(cè)定多糖含量是比較有效的方法，利用多糖與濃硫酸反應(yīng)生成糠醛衍生物，再與苯酚生成橙色物質(zhì)，該物質(zhì)在最大吸收波長(zhǎng)約490nm處，其吸光度與多糖濃度呈線(xiàn)性關(guān)系［7-8］，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，即可計(jì)算含量。方法學(xué)考察實(shí)驗(yàn)表明，該方法操作簡(jiǎn)單，有較高的靈敏度，數(shù)據(jù)可靠，可作為大柴胡湯中總多糖含量測(cè)定的方法。