特立氟胺微乳的制備及其體外透皮吸收研究

王 東，曹雅茹，金 涌，程節玲，顏傳文

特立氟胺(teriflunomide, TEF) 是類風濕關節炎治療藥物來氟米特(leflunomide, LEF)在體內的活性代謝物。LEF通過體內生成TEF而抑制二氫乳酸脫氫酶(DHODH)，阻礙來自淋巴細胞的嘧啶生成，干擾酪氨酸脫氫酶的活性。LEF由于其嚴重的肝損害，2010年美國FDA予以黑框警告。2012年特立氟胺口服制劑Aubagio在美國上市，上市后患者因無法耐受胃腸道反應和肝毒性而停止服藥。FDA已對Aubagio致嚴重肝損傷風險予黑框警告。因此如何能減輕或避免TEF肝損害的研究具有重要意義。微乳 (microemulsion, ME)是由四相(油相、水相、乳化劑和助乳化劑)組成的，具有澄清透明、黏度低、熱力學穩定和各向同性等特點的油水混合體系。其粒徑介于10～100 nm，制備程序簡單，操作方便，無需特殊設備，可通過過濾除菌[1-3]。外用ME體內可通過淋巴轉運后吸收，能減少胃腸道代謝過程及肝臟的首過效應，減輕肝毒性[4]。該研究組通過對特立氟胺ME的處方篩選、優化，制備最佳處方比的特立氟胺外用ME，并對其體外透皮性能進行考察，為后續特立氟胺ME體內藥代動力學研究做鋪墊。

1 材料與方法

1.1儀器Franz擴散池(自制)；LC-20 A 型高效液相色譜儀(日本島津公司)；NanoZS 90型激光納米粒度儀(英國馬爾文公司)；79 HW-1型恒溫磁力攪拌器(江蘇金壇金城國勝實驗儀器廠)；JEM-100 SX型透射式電子顯微鏡(日本電子株式會社)；DDS-11 AW 型電導率儀(上海般特儀器有限公司)；Milli-Q Integral 15型超純水機(美國Millipore公司)。

1.2試劑特立氟胺對照品(自制，質量分數為99%)；辛癸酸甘油酯(ODO，山東西亞試劑公司，批號：T0809)；大豆磷脂(Lecithin，上海艾韋特有限公司，批號：170103)；油酸(OA，阿拉丁試劑公司，批號：160129)；肉豆蔻酸異丙酯(IPM，國藥集團化學試劑，批號：17A0305)；吐溫80(天津光復精細化工研究所，批號：20170301)；水為雙蒸水；其余試劑均為分析純。

1.3動物SD大鼠，雄性，8只，普通級，體重(225±25)g，由安徽醫科大學實驗動物中心提供。給予正常飲食，在標準環境飼養1周。

1.4方法

1.4.1ME偽三元相圖的繪制 按一定質量比(Km=乳化劑/助乳化劑)，分別精密稱取乳化劑和助乳化劑于透明、干燥的具塞安瓿瓶中，相互混合并溶解，即得混合乳化劑，將油相與混合乳化劑按如下質量比(9 ∶1、8 ∶2、7 ∶3、6 ∶4、5 ∶5、4 ∶6、3 ∶7、2 ∶8、1 ∶9 )分別混合，恒溫磁力攪拌器攪拌，觀察渾濁情況，在澄明液中緩慢滴加雙蒸水，肉眼觀察液體由澄明轉為渾濁(即臨界點)，記錄此時ME組成的質量百分比。采用Origin8.0軟件對偽三元相圖的相關數據進行處理，并繪制偽三元相圖，比較ME區域大小。

1.4.2組分互溶性考察及助乳化劑的選擇 選擇司盤80、大豆磷脂、司盤80-吐溫80復合物(MIX 80，HLB=5.0)為乳化劑，異丙醇、無水乙醇、1，2-丙二醇、PEG 400為助乳化劑。觀察25 ℃下不同乳化劑與助乳化劑的互溶情況(溶解性、流動性、澄明度)，初步確定混合乳化劑的組成。

1.4.3處方篩選

1.4.3.1乳化劑的選擇 25 ℃下，以無水乙醇為助乳化劑，IPM為油相，固定Km值=1 ∶1，分別考察大豆磷脂、司盤80、MIX 80所形成的ME區域大小。

1.4.3.2油相的選擇 25 ℃下，固定Km值(乳化劑/助乳化劑)為1 ∶1，油相與混合乳化劑質量比6 ∶4，比較油相為OA、IPM、ODO、EO時ME區域大小。

1.4.3.3混合乳化劑比例的確定 25 ℃下，以油相與混合乳化劑質量比1 ∶1，考察Km值為1 ∶2、2 ∶3、1 ∶1、3 ∶2和2 ∶1時ME區域面積大小。

1.4.4ME的制備 將乳化劑與助乳化劑混合溶解，再加入油相混合，在攪拌下將特立氟胺水溶液緩慢滴入上述液體中，攪拌30 min，即得特立氟胺ME。

1.4.5ME質量評價方法

1.4.5.1性狀 目視觀察制備的特立氟胺ME的性狀。

1.4.5.2特立氟胺ME的鑒別 ① 染色法：取A、B兩燒杯，加入相同體積特立氟胺ME，A加2滴亞甲藍(水性染料)，B加2滴蘇丹紅(油性染料)，室溫靜置10 min; ② 電導率法: 取同體積特立氟胺ME、空白ME、特立氟胺水溶液和IPM。采用電導率儀測定樣品電導率。

1.4.5.3ME的粒徑分布 取“1.4.4”制備的ME，用粒度儀測定ME的粒徑分布。

1.4.5.4ME顯微形態的觀察 常溫下取適量稀釋5倍的特立氟胺ME滴在銅網上(覆有支持膜)，靜置15 min，待自然晾干后用1%磷鎢酸溶液負染10 min，自然揮干，透射電鏡下觀察。

1.4.5.5穩定性考察 取特立氟胺ME適量在3 000 r/min離心10 min，結果ME仍澄清、透明，且不分層。另取特立氟胺ME 20 ml于具塞試管中，在室溫條件下放置6個月，分別于0、1、2、3、6個月觀察體系是否透明、澄清，有無分層及沉淀等現象，并測定ME中藥物含量、電導率。

1.4.6含量測定方法

1.4.6.1溶液的配制 ① 對照品溶液的配制：精密稱取特立氟胺對照品25 mg，加適量甲醇溶解，移入25 ml容量瓶后加甲醇定容搖勻，精密量取5 ml于25 ml容量瓶中，加甲醇定容搖勻，即得200.00 μg/ml的特立氟胺對照品儲備液； ② 供試品溶液的配制：精密稱取制備的ME適量，加適量甲醇破乳，移入50 ml容量瓶中加甲醇定容后超聲30 min，3 000 r/min離心10 min，精密量取10 ml于25 ml容量瓶中，加甲醇定容，微孔濾膜(0.45 μm)濾過得200.00 μg/ml供試品儲備液； ③ 空白供試品溶液的配制：將精密稱取空白ME 10.00 g，余操作同②。所有配制溶液置4 ℃冰箱保存。

1.4.6.2色譜條件 色譜柱：ODS-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相：0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.4) ∶甲醇=43.8 ∶56.2；流速1.00 ml/min；柱溫40 ℃；檢測波長294.0 nm；進樣量20 μl；內標10.0 μg/ml尼泊金甲酯。

1.4.6.3專屬性實驗 分別吸取“1.4.6.1”項中的3種溶液，稀釋后的按“1.4.6.2”項條件進樣。觀察空白ME中是否有成分對特立氟胺峰有干擾。

1.4.6.4線性關系考察 精密量取“1.4.6.1”項①儲備液，依次用甲醇稀釋，得100.00、50.00、25.00、12.50、6.25、3.125 μg/ml的系列標準液，依次進樣，以藥物峰面積(A)對藥物濃度(C, μg/ml)進行線性回歸。

1.4.6.5精密度實驗 精密量取特立氟胺對照品溶液1 ml于10 ml容量瓶中，加甲醇定容搖勻，按“1.4.6.2”項重復進樣(n=6)測定峰面積，根據標準曲線求得濃度，計算精密度。

1.4.6.6穩定性實驗 取ME供試品溶液，分別在0、2、4、6、12、24、48 h時進樣，按“1.4.6.2”項進樣測定峰面積。

1.4.6.7重復性實驗 精密量取特立氟胺ME 6份(同批次)，按“2.6.1.2”項下制成供試品溶液，按“1.4.6.2”項進樣測定峰面積。

1.4.6.8回收率實驗 精密量取低、中、高濃度(0.25、1.00、2.50 mg/ml)特立氟胺溶液1 ml，分別加入含空白ME 0.5 g的3個10 ml容量瓶中，分別按“1.4.6.1”項②處理，“1.4.6.2”項平行進樣(n=3)，計算回收率。

1.4.6.9樣品的含量測定 取ME的3個不同批次，按照“1.4.6.1”項②制成溶液，按“1.4.6.2”進樣測定。

1.4.7體外透皮實驗方法

1.4.7.1鼠皮制備 取大鼠，斷頸后刮凈背部毛發，剝離背部皮膚(避免損傷)，小心去除粘連物和皮下脂肪，用0.9%氯化鈉溶液沖洗干凈，置0.9%氯化鈉溶液中4 ℃保存，7 d內用完。

1.4.7.2樣品制備 精密稱取ME各成分，按“1.4.4”方法制備特立氟胺ME；采用干膠法制備特立氟胺普通乳劑；另將特立氟胺溶于雙蒸水中得特立氟胺水溶液。所有制備的樣品避光密封保存。

2 結果

2.1ME處方組成與最佳處方比結果

2.1.1組分互溶性和助乳化劑的選擇 助乳化劑PEG 400、1，2-丙二醇與各乳化劑的的互溶情況均較差，故不適宜制備ME。不同乳化劑在異丙醇和無水乙醇中均表現出良好的溶解性和流動性，但助乳化劑為異丙醇時體系澄明度差于無水乙醇，故選擇無水乙醇為助乳化劑。

2.1.2乳化劑的選擇 大豆磷脂所形成ME區域最大，MIX 80和司盤80所形成的ME區域面積均較小。因此確定大豆磷脂為乳化劑。見圖1。

2.1.3油相的選擇 IPM所形成ME區域最大，EO和ODO的ME區域面積相對較小，OA的ME區域最小。故確定IPM為油相。見圖2。

2.1.4混合乳化劑比例的確定 在Km=1 ∶1時，ME區域面積最大，因此確定混合乳化劑Km=1 ∶1。見圖3。

2.1.5最佳處方比的確定 該實驗水相用量為最大載水量的70%時形成的ME最穩定，結合制備的ME穩定性和成本等因素，最終選擇油相與混合乳化劑的質量比為1 ∶1。最終確定最佳處方質量比為IPM ∶大豆磷脂 ∶無水乙醇 ∶雙蒸水=42.12 ∶21.06 ∶21.06 ∶15.76。

2.2特立氟胺ME的制備精密稱取特立氟胺5.0 mg、IPM 2.106 g、大豆磷脂1.053 g、無水乙醇1.053 g、雙蒸水0.783 g，按“1.4.4”制備特立氟胺ME。

2.3特立氟胺ME的質量評價

2.3.1性狀 ME為流動性好的黃色澄明液體，存在丁達爾現象。見圖4。

2.3.2特立氟胺ME的鑒別

2.3.2.1染色法 蘇丹Ⅲ(顯紅色)在ME中的擴散速度快于亞甲基藍(顯藍色)，故所得ME屬油包水(W/O)型。見圖5。

2.3.2.2電導率法 實驗測得空白ME和特立氟胺ME的電導率值略低于IPM的電導率值，但明顯低于特立氟胺水溶液，故判定ME為W/O型ME。

2.3.3ME的粒徑分布 粒徑分布見圖6，測定3次的粒徑為(35.18±0.28) nm，PDI為(0.184±0.02)，說明ME粒徑大小適宜，且粒徑范圍較窄，分布集中。

2.3.4ME顯微形態的觀察 電鏡照片見圖7，在電鏡下ME乳滴為表面完整的圓球形，符合ME的粒徑要求。

圖1 3種不同乳化劑的偽三元相圖

圖2 4種油相的偽三元相圖

圖3 5種Km值的偽三元相圖

圖4 特立氟胺ME外觀

圖5 特立氟胺ME類型

圖6 特立氟胺ME的粒徑分布

2.3.5穩定性考察 結果體系透明、澄清，無分層及沉淀；藥物含量、電導率均保持穩定，說明ME具有良好的穩定性。

2.4特立氟胺ME的含量測定

2.4.1專屬性實驗 特立氟胺色譜峰不受其他物質干擾，專屬性良好，保留時間為10.9 min。見圖8。

圖7 特立氟胺ME的透射電鏡觀察 ×124 000

2.4.2線性關系 回歸方程為A=0.121 0C-0.512 5(R2=0.999 6)，結果顯示特立氟胺在3.125～100.00 μg/ml范圍內線性良好。

2.4.3精密度實驗 結果相對標準偏差(relative standard deviation, RSD)為0.52%，說明儀器精密度良好。

2.4.4穩定性實驗 結果RSD為0.79%，結果表明特立氟胺ME穩定性良好。

圖8 特立氟胺的高效液相色譜圖

樣品加入量(mg)檢出量(mg)回收率(%)平均回收率(%)RSD(%)10.250 00.259 2103.6810.250 00.264 5105.80104.631.0310.250 00.261 0104.4021.000 01.016 1101.6121.000 01.019 6101.96101.940.3021.000 01.022 5102.2532.500 02.512 4100.4932.500 02.523 5100.94100.720.2032.500 02.518 3100.73

表2 不同組成特立氟胺制劑

2.4.5重復性實驗 計算得峰面積RSD為0.61%，表明該方法重復性良好。

2.4.6回收率實驗 結果見表1，3種濃度的回收率均符合要求。

2.4.7樣品的含量測定 結果特立氟胺ME含量分別為203.35、194.62、206.09 μg/ml，平均為(201.35±5.99)μg/ml。

2.5體外透皮實驗

2.5.1樣品制備 按表2精密稱取ME各組分，按“1.4.7.2”方法制備，即得表2示的ME、乳劑及水溶液。

2.5.2透皮實驗結果 4種特立氟胺樣品的滲透曲線見圖9。分別以0.1%、0.25%特立氟胺ME的Qn對滲透時間(t)進行回歸分析。回歸方程分別為Qn=2.698 2t+0.297 1(R2=0.997 1)、Qn=6.138 6t+0.532 3(R2=0.998 1)。0.1%和0.25%特立氟胺ME的Qn對滲透時間(t)線性關系的良好。

4種樣品的滲透系數和累計滲透量結果見表3。0.25%特立氟胺ME較0.1%特立氟胺ME的Q24 h顯著升高；0.1%特立氟胺ME的Q24 h較其普通乳劑和水溶液亦顯著升高，說明ME能有效促進特立氟胺的透皮吸收，且經皮累計滲透量隨藥物劑量的增加而增多。

圖9 4種特立氟胺樣品的滲透曲線圖

3 討論

ME處方各組分的確定及最佳處方比是ME制備研究的重點，亦是難點。在保證ME穩定和最少乳化劑使用的基礎上，該研究選擇IPM ∶大豆磷脂 ∶無水乙醇 ∶雙蒸水比為42.12 ∶21.06 ∶21.06∶15.76，制備了W/O型特立氟胺ME。IPM和ODO均為中鏈甘油酯，具有生物相容性、載水量高、對人體無毒等優點[5]。由于IPM載水量較大，乳化劑需求量相對較小，形成的ME面積大，故最終選擇其為油相。大豆磷脂是一種天然的兩性離子表面活性劑，具有乳化能力強、生物相容性好和毒性小等優點，亦有促進藥物透皮吸收的作用[6]。無水乙醇作為助乳化劑，可通過降低水相的極性，減少表面張力，彌補單用大豆磷脂時油水界面膜流動性差的不足，無水乙醇與大豆磷脂的組合更有利于ME的形成[7]。該研究通過離體鼠皮的滲透實驗，考察了不同制劑及濃度對累積滲透量和滲透速率的影響，結果表明，特立氟胺ME的經皮滲透作用明顯高于同濃度普通乳劑及水溶液，該結果與相關報道[8]一致。

表3 4種特立氟胺樣品的滲透系數

與0.25%特立氟胺ME比較：*P<0.01；與0.1%特立氟胺普通乳劑比較：#P<0.01；與0.1%特立氟胺水溶液比較：▽P<0.01