大株紅景天注射液抗大鼠急性心肌缺血作用△

邱久文，李志強，王紅穎，房宗寶，吳海波，林天澤，李美松

（1.通化玉圣藥業有限公司，吉林 通化 134008；2.浙江大遠智慧制藥工程技術有限公司，浙江 杭州 310000）

大株紅景天注射液為大株紅景天Rhodiola kirilowii（Regel）Regel.干燥根及根莖經水提醇沉制備而成的中藥注射劑，于2006年批準上市，是選用紅景天單味藥研制的治療冠心病、心絞痛的臨床急癥注射用藥，臨床上還被廣泛用于腦卒中、心衰、心肌梗死以及肺病、肝臟疾病的治療。經研究表明大株紅景天注射液的主要化學成分有紅景天苷、酪醇及其苷類、黃酮類、苯丙素類、萜類、有機酸及其苷類等[1-2]。現代藥理學研究證實，紅景天提取物具有抗衰老、抗腫瘤、抗病毒、抗菌、抗缺氧、抗疲勞、抗輻射、抗氧化、鎮痛、對中樞神經及內分泌系統雙向調節等多種藥理活性。實驗研究發現紅景天苷在實驗性大鼠心肌缺血損傷方面具有保護作用，其抗心肌缺血損傷的作用機制主要是通過清除氧自由基、抗氧化抗凋亡、提高O型乙酰葡萄胺蛋白質水平以及促進缺血區血管新生減小梗死面積等途徑[3-7]。為了驗證大株紅景天注射液在治療冠心病心絞痛方面的作用，本文采用冠狀動脈結扎法造成大鼠急性心肌缺血模型，觀察大株紅景天注射液的抗心肌缺血作用。

1 材料

1.1 受試藥物

大株紅景天注射液（通化玉圣藥業有限公司），規格：5 mL／支，批號：3／1001150608。

1.2 儀器與試劑

小動物呼吸機（上海奧爾科特生物科技有限公司），INFINITE M1000全波長多功能酶標儀，MP150生理記錄儀（美國BIOPAC公司），CTNI測定試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號：201605），CK測定試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號：201606），LDH測試盒（南京建成生物工程研究所，批號：201606），2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC，南京建成生物工程研究所，規格：每瓶5 g，批號：201605）。以pH 7.4磷酸鹽緩沖液配制成所需的溶液供染色用。

1.3 動物

SD大鼠40只，SPF級，雄性，220～260 g，購自浙江大學實驗動物中心。動物合格證：SCXK（浙）2014-0001。

2 方法

2.1 動物分組

采用隨機數字表法隨機分為4組，假手術組（Sham Operation Group，SO）、模型對照組（Model Group，MG）、紅景天低劑量組（HJTL）、紅景天高劑量組（HJTH），每組10只。低劑量組和高劑量組分別每天尾靜脈注射紅景天原液2、4 mL·kg－1，連續7 d，假手術組和模型組給予等量的0.9%氯化鈉溶液。

2.2 模型制備

將大鼠戊巴比妥（50 mg·kg－1）腹腔注射麻醉，仰臥位固定。二導聯心電圖動態監測。沿左側第4、5肋間剪開左胸部皮膚，少量鈍性分離胸肌，止血鉗撐開胸廓，暴露心臟，將心臟輕輕擠出胸壁外，于肺動脈圓錐與左心耳之間，距左冠狀動脈前降支起始部3 mm處穿線（用帶有4-0縫合線的3／8彎針鉤），結扎冠狀動脈前降支，隨后將心臟送回胸腔，擠出胸腔內空氣，閉合胸腔縫合傷口并接呼吸機，恢復自主呼吸。假手術組大鼠的手術過程與上述相同，只穿線不結扎冠狀動脈。

2.3 心肌梗死范圍測定及組織學檢測

模型大鼠連續給藥7 d后，迅速摘離心臟，0.9%氯化鈉溶液中清洗，除去血管等異物，每組取7只將心臟均勻切成5片，并置于1%TTC溶液中，37℃加熱5 min，非梗死區呈鮮紅色，梗死區呈灰白色。顯微鏡拍照，用圖像處理軟件Image Pro Plus統計梗死面積占心臟切片總面積的比重。每組取3只心臟進行組織學檢測，心臟組織固定于10%福爾馬林中，后用石蠟包埋。石蠟包埋的心臟組織制成石蠟切片后用蘇木精-伊紅染色法（HE染色）進行染色，以及進行免疫組織化學染色，于400X光學顯微鏡下觀察采集圖像。

2.4 心肌酶和心肌肌鈣蛋白的測定

大鼠末次給藥30 min后，腹腔注射戊巴比妥鈉60 mg·kg－1麻醉，腹主動脈取血，3.2%枸櫞酸鈉抗凝，全血與抗凝劑體積之比9∶13，500 r·min－1離心10 min分離血漿，置于冰箱（－20℃）保存備用。按試劑盒方法測定血漿肌酸激酶（CK）、心肌肌鈣蛋白（CTNI）、乳酸脫氫酶（LDH）活性，每組檢測7份血樣。

2.5 統計學處理

3 結果

3.1 急性心肌缺血大鼠心肌梗死面積的變化

冠狀結扎前后大鼠心電圖改變如圖1所示。大鼠左心室薄片經TTC染色觀察梗死發生的狀況，在體視顯微鏡下觀察表明，對照組梗死區域極小，模型組梗死區域較大，紅景天低、高劑量組給藥后心肌缺血梗死區域小于模型組。對梗死區域（白色部分）面積用Image Pro Plus軟件進行統計，計算梗死區面積與整個心肌薄片面積的比值。結果表明，與模型組比較，低劑量和高劑量組的心肌梗死面積數值顯著降低，具有統計學差異（P＜0.05，P＜0.01），見圖 2、圖3。

圖1 冠脈結扎前后大鼠心電圖改變

圖2 不同濃度大株紅景天注射液對大鼠急性心肌梗死面積區域影響 （n＝7）

3.2 心臟組織HE和免疫組化染色后的觀察結果

大鼠左心室切片經HE染色觀察組織形態，在光學顯微鏡下觀察表明，假手術組正常心肌細胞排列整齊，胞質染色均勻，核成圓形或橢圓形，染色質分布均勻，模型組梗死區域出現大片無核區域。黏附分子CD11b免疫組織化學結果顯示模型組梗死區域中性粒細胞表面CD11b表達明顯增多，炎性細胞浸潤嚴重。紅景天低、高劑量組給藥后可逆轉該現象。結果表明，與模型組比較，低劑量和高劑量組可抑制急性心肌缺血大鼠炎性細胞浸潤，減少心肌梗死面積，如圖4、圖5所示。

圖3 不同濃度大株紅景天注射液對大鼠急性心肌梗死面積比率的影響（n＝7）

3.3 不同濃度大株紅景天注射液對心肌缺血大鼠血漿心肌肌鈣蛋白CTNI影響

實驗結束時，各組大鼠腹主動脈采血，分離血漿，測定大鼠血漿心肌肌鈣蛋白CTNI水平。結果可見，與假手術組比較，模型組的心肌肌鈣蛋白數值明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，低劑量組的血漿肌鈣蛋白水平降低，但無統計學差異（P＞0.05），高劑量組的血漿肌鈣蛋白水平顯著降低，具有統計學差異（P＜0.01），結果見圖6。

3.4 不同濃度大株紅景天注射液對大鼠血漿肌酸激酶CK的影響

實驗結束時，各組大鼠腹主動脈采血，分離血漿，測定各組大鼠血漿肌酸激酶CK。結果可見，與假手術組比較，模型組的肌酸激酶CK明顯升高（P＝0.313 0）；與模型組比較，大株紅景天低、高劑量組的心肌酶水平有降低趨勢（P＝0.549 7，P＝0.094 4），并呈現出量效相關性，結果見圖7。

3.5 不同濃度大株紅景天注射液對大鼠血漿乳酸脫氫酶LDH的影響

實驗結束時，各組大鼠腹主動脈采血，分離血漿，測定各組大鼠血漿乳酸脫氫酶LDH。結果可見，與假手術組比較，模型組的乳酸脫氫酶LDH數值明顯升高（P＝0.056 1）；與模型組比較，大株紅景天低、高劑量組的乳酸脫氫酶水平呈現出降低的趨勢（P＝0.439 7，P＝0.330 5），結果見圖8。

圖4 不同濃度大株紅景天注射液對心肌缺血大鼠左心室橫截面HE及CD11b染色情況的影響（n＝3）

圖5 不同濃度大株紅景天注射液對心肌缺血大鼠左心室組織中炎性細胞聚集作用比較（n＝3）

圖6 不同濃度大株紅景天注射液對心肌缺血大鼠血漿心肌肌鈣蛋白CTNI的影響（n＝7）

圖7 不同濃度大株紅景天注射液對心肌缺血大鼠血漿肌酸激酶CK的影響（n＝7）

圖8 不同濃度大株紅景天注射液對心肌缺血大鼠血漿乳酸脫氫酶LDH的影響（n＝7）

4 討論

大鼠心肌缺血造模方法很多，經典的造模方法為結扎大鼠心肌冠狀動脈左前降支，造成心肌缺血模型。冠狀動脈結扎法能人為模擬臨床心肌梗死過程中冠狀動脈梗死，其梗死部位、分布范圍相對一致，病理生理、生化改變與臨床心肌梗死相似[8]。本實驗采用手術結扎大鼠冠狀動脈左前降支方法制做急性心肌缺血模型。結果顯示，與模型組比較，低劑量和高劑量組的心肌梗死面積數值明顯降低，具有統計學差異（P＜0.05，P＜0.01），說明大株紅景天注射液在低劑量和高劑量組能有效降低心肌梗死大鼠的梗死面積。大鼠左心室切片經HE染色觀察組織形態，觀察到模型組梗死區域出現大片無核區域，而大株紅景天注射液干預后可改善這一現象，進一步確證了大株紅景天注射液能有效降低心肌梗死大鼠的梗死面積。免疫組化結果顯示，與模型組相比，低劑量和高劑量的心肌梗死區域中性粒細胞表面黏附分子CD11b表達明顯降低，顯著改善炎性細胞浸潤水平，并且具有統計學差異（P＜0.01），說明紅景天注射液在低劑量和高劑量能夠有效抑制心肌梗死大鼠的炎性細胞浸潤。

CTNI在預測MIS、評估溶栓效果、鑒別不穩定性心絞痛等多個領域有重要價值，常被作為診斷心肌損傷的標志物，具有高靈敏度、高特異性、出現早、持續時間長的特點[9-10]。心肌缺血損傷時，由于自由基堆積和Ca2＋超載，損傷了細胞膜和線粒體，CTNI可通過破損的細胞膜彌散進入細胞間質，隨之進入血管和淋巴管內引起血漿中 CTNI的增加[11]，因此觀察藥物對心肌CTNI的影響，是判斷其是否具有抗心肌缺血損傷作用的一個主要指標。本實驗中，與模型組比較，低劑量組的血漿肌鈣蛋白水平低于模型組，但無統計學差異（P＞0.05），高劑量組的血漿肌鈣蛋白水平顯著降低，具有統計學差異（P＜0.01），說明大株紅景天注射液在高劑量組濃度下能夠有效減輕心肌缺血大鼠心肌損傷。

LDH是一種糖酵解酶，是體內能量代謝過程中的一種重要的酶，此酶幾乎存在于所有的組織中，當少量組織壞死時此酶即釋放入血，使其在血液中的活力升高[12]。CK通常存在于心臟、肌肉、腦等組織的細胞漿和線粒體中，是一個與細胞內能量轉運、肌肉收縮、ATP再生有直接關系的重要激酶，肌酸激酶在臨床診斷中有重要的意義，在各種病變包括肌肉萎縮和心肌梗死發生時血漿中的肌酸激酶水平迅速升高[13]。本實驗中，與模型組比較，大株紅景天注射液低、高劑量組均能一定程度地降低CK和LDH水平，其中大株紅景天高劑量組CK和LDH下降趨勢較大株紅景天低劑量組更為明顯，可見大株紅景天對心肌梗死大鼠血清LDH、CK的影響有一定的量效關系。

綜上所述，大株紅景天注射液在高劑量時能夠有效減少急性心肌梗死大鼠的心肌梗死面積，顯著改善心肌梗死區域炎性細胞浸潤，顯著降低血漿心肌肌鈣蛋白CTNI的水平，并能降低血漿心肌酶CK和LDH的活力，高劑量濃度（4 mL·kg－1）對急性心肌缺血大鼠有良好的保護作用。