柴芪湯對代謝綜合征模型大鼠血清ICAM-1和VCAM-1的影響△

王紅梅，葛秉宜，王穎，劉晶，朱夢云，張立平

（1.北京中醫藥大學東方醫院，北京 100078；2.北京市懷柔區中醫醫院，北京 101400；3.北京中醫藥大學研究生院，北京 100029）

代謝綜合征（metabolic syndrome，MetS）包括腹型肥胖、胰島素抵抗或糖耐量異常、高血壓、血脂異常4個疾病組分[1]，越來越多的研究認為MetS關鍵發病因素為胰島素抵抗，其最終可導致心肌梗死、中風等心腦血管惡性事件的發生，故MetS又被稱為胰島素抵抗綜合征和代謝性心腦血管綜合征[2]。一些研究[3-7]認為MetS的慢性炎癥狀態是MetS最終發展為動脈粥樣硬化的病理基礎，其中細胞間黏附分子1（ICAM-1）和血管細胞黏附分子1（VCAM-1）在動脈粥樣硬化形成過程中起著重要的作用[8]，MetS病人的ICAM-1和VCAM-1水平明顯增高[9]，因此黏附因子也成為評價MetS療效的有用工具[10]。

本課題組既往工作證實具有健脾疏肝、活血化瘀功效的柴芪湯（由黃芪、柴胡、白術、枳實及三七粉組成）干預MetS有效，對相關炎性因子具有調節作用[11-15]。本研究使用喂養型MetS大鼠模型觀察柴芪湯對ICAM-1和VCAM-1的動態影響，進一步研究柴芪湯防治MetS療效及可能的抗炎作用機制。

1 材料

1.1 實驗動物

清潔級雄性SD大鼠60只，8周齡，體質量（280±10）g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司 [實驗動物許可證號：SCXK（京2012-0001）]。

1.2 藥物和試劑

自擬方柴芪湯由黃芪30g、柴胡10 g、白術10 g、枳實10 g及三七粉3 g 5味中藥組成，上述飲片購自北京中醫藥大學東方醫院中藥房，并由該院煎藥室代煎制備，煎制過程嚴格遵照國家中醫藥管理局制定的 《醫療機構中藥煎藥室管理規范》（國中醫藥發 〔2009〕3號）執行。

普通清潔級動物飼料及高脂高糖高鹽配制飼料（含大鼠基礎飼料52.5%、其余由熟豬油10%、蛋黃粉10%、膽固醇2%、奶粉10%、果糖10%、食用鹽5%、膽鹽0.5%組成）均由北京科澳協力飼料有限公司提供。

生化試劑盒購自中生北控生物科技股份有限公司，放射免疫分析試劑盒購自北京福瑞潤康生物技術有限公司，酶聯免疫分析（ELISA）試劑盒購自上海聯碩生物科技有限公司。

2 方法

2.1 分組

60只雄性SD大鼠隨機分為3組，染發劑標號，分別為正常組18只，模型組24只，中藥預防組18只。在第8周末取材后，從模型組中隨機抽取6只作為中藥治療組，此時共4組大鼠，每組6只（筆者前期實驗研究[11-15]已經比較了柴芪湯與羅格列酮組對MetS的療效。而本研究重點探討柴芪湯預防性給藥和治療性給藥的療效差異，故未設陽性對照藥組）。以上大鼠采取分籠飼養，每籠6只，動物室室內溫度19～24℃，相對濕度60%～70%，自由飲水，明暗周期12 h／12 h，各組大鼠分籠適應性喂養7 d后開始模型制備。

2.2 造模

正常組：僅給基礎飼料12周。模型組：給予高脂高糖高鹽飼料12周。中藥預防組：自造模第1周開始給予高脂高糖高鹽飼料12周，從第1周給予柴芪湯 5.71 g·kg－1·d－1灌胃（本研究重點不是探討柴芪湯的量效關系，而且本課題組前期研究[11]已經就柴芪湯高中低劑量對MetS的治療效果進行了探討。本研究依照 “人和動物間按體表面積折算的等效劑量比值”計算柴芪湯的等效劑量，該計算方法為大家公認，且與本課題組上述研究結果一致）。中藥治療組：自造模第1周開始給予高脂高糖高鹽飼料12周，從第 9周給予柴芪湯 5.71 g·kg－1·d－1灌胃。每天給予正常組和模型組等同中藥組所灌服中藥體積的0.9%氯化鈉溶液灌胃。

2.3 取材

于第4、8、12周的周末進行取材，每組隨機抽取6只。

大鼠血清的獲取：取血前禁食12 h，10%水合氯醛腹腔注射麻醉（3.7 mL·kg－1），真空采血管腹主動脈取血，靜置0.5 h后置于離心機中以4℃、3000 r·min－1離心15 min，移液槍吸取血清，放置－80℃冰箱凍存備用。

2.4 指標測定

全自動生化分析儀檢測血清三酰甘油（TG）、總膽固醇（TC）、高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL）、空腹血糖（FBG）。放免法檢測空腹胰島素（FINS）。ELISA法測定血清 ICAM-1、VCAM-1。上述具體操作按照試劑盒說明書。根據FBG和FINS，按照HOMA穩態模型，計算出胰島素抵抗指數（IRI）＝（FBG×FINS／22.5），評價胰島素抵抗情況。

2.5 統計方法

3 結果

3.1 各組大鼠血清FGB、FINS、IRI和血脂比較

第8周模型組與正常組相比，模型組FBG增高，差異有統計學意義（P＜0.05）；FINS值增高，但無統計學差異（P＞0.05）；IRI值較低，差異有統計學意義（P＜0.01）。

第12周中藥治療組與模型組相比，治療組FBG、FINS、IRI均降低，差異有統計學意義（P＜0.01）。中藥預防組與模型組相比，預防組 FBG、FINS、IRI均降低，差異有統計學意義（P＜0.01）。中藥預防組與治療組相比，預防組FBG和FINS均較低，但無統計學差異（P＞0.05），預防組IRI值較治療組低，且差異有統計學意義（P＜0.05）。結果見表1。

第8周模型組與正常組相比，模型組TC及LDL升高，差異有統計學意義（P＜0.01）；模型組TG較高，差異有統計學意義（P＜0.05）；模型組HDL較正常組略低，但兩組間差異不具有統計學意義（P＞0.05）。

第12周中藥治療組與模型組相比，治療組TC、TG、LDL均降低，差異有統計學意義（P＜0.01），而兩組間HDL無統計學差異（P＞0.05）。中藥預防組與模型組相比，預防組TC、TG、LDL均降低，差異有統計學意義（P＜0.01），而兩組間HDL無統計學差異（P＞0.05）。中藥預防組與治療組相比，預防組TC較低，有統計學差異（P＜0.05）；LDL也降低，有統計學差異（P＜0.01）；而兩組間TG及HDL無統計學差異（P＞0.05）。結果見表2。

表1 柴芪湯各組大鼠血清FGB、FINS和IRI變化（±s，n＝6）

表1 柴芪湯各組大鼠血清FGB、FINS和IRI變化（±s，n＝6）

注：與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與中藥預防組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01；下同。

IRI第8周 第12周 第8周 第12周 第8周 第12周正常組 7.12±1.39 8.26±0.67 6.57±1.38 6.60±0.71 2.04±0.44 2.41±0.24模型組 9.47±2.25* 10.55±1.55** 7.64±1.39 8.37±1.24* 3.14±0.48** 3.93±0.81**中藥預防組 6.88±1.31△ 4.77±0.63**△△ 7.75±0.92 4.89±1.10*△△ 2.39±0.58△ 1.04±0.27**△△中藥治療組 6.11±0.69**△△＃ 6.15±1.37△△ 1.67±0.42*△△＃FBG／mmol·L－1 FINS／mIU·L－1組別

表2 柴芪湯各組大鼠TC、TG、HDL、LDL變化±s，n＝6）mmol·L－1

表2 柴芪湯各組大鼠TC、TG、HDL、LDL變化±s，n＝6）mmol·L－1

TC TG HDL LDL第8周 第12周 第8周 第12周 第8周 第12周 第8周 第12周正常組 1.56±0.28 1.91±0.25 0.24±0.07 0.34±0.07 1.13±0.22 1.11±0.29 0.22±0.04 0.42±0.05模型組 2.30±0.30**2.37±0.22** 0.32±0.07* 0.45±0.08* 1.02±0.19 1.08±0.11 0.55±0.20**0.53±0.06**中藥預防組 1.82±0.35△ 1.25±0.15**△△ 0.20±0.05△△ 0.20±0.02**△△ 0.92±0.22 1.25±0.26 0.39±0.10*△ 0.24±0.04**△△中藥治療組 1.55±0.23*△△＃ 0.27±0.07△△ 1.13±0.11 0.33±0.07*△△＃＃

3.2 各組大鼠血清ICAM-1濃度比較

第4周的模型組ICAM-1濃度較正常組升高，差異具有統計學意義（P＜0.01）；中藥預防組相比正常組升高，差異具有統計學意義（P＜0.01）；中藥預防組與模型組之間的差異不具有統計學意義（P＞0.05）。

第8周的模型組ICAM-1濃度相比正常組升高，差異具有統計學意義（P＜0.01）；中藥預防組相比正常組升高，差異具有統計學意義（P＜0.05）；中藥預防組的ICAM-1濃度低于模型組，差異具有統計學意義（P＜0.05）。

第12周的模型組ICAM-1濃度相比正常組升高，差異具有統計學意義（P＜0.01）；中藥治療組和中藥預防組較正常組均升高，差異具有統計學意義（P＜0.05）；中藥治療組低于模型組，但差異不具有統計學意義（P＞0.05）；中藥預防組低于模型組，差異具有統計學意義（P＜0.01）；中藥預防組低于治療組，兩者間差異具有統計學意義（P＜0.05）。結果見表3。

3.3 各組大鼠血清VCAM-1濃度比較

第4周的模型組VCAM-1濃度較正常組升高，差異具有統計學意義（P＜0.01）；中藥預防組相比正常組升高，但差異不具有統計學意義（P＞0.05）；中藥預防組低于模型組，差異不具有統計學意義（P＞0.05）。

第8周的模型組VCAM-1濃度相比正常組升高，差異具有統計學意義（P＜0.01）；中藥預防組相比正常組升高，差異不具統計學意義（P＞0.05）；中藥預防組低于模型組，差異不具有統計學意義（P＞0.05）。

第12周的模型組VCAM-1濃度相比正常組升高，差異具有統計學意義（P＜0.01）；中藥治療組較正常組升高，差異具有統計學意義（P＜0.01）；中藥預防組較正常組升高，差異不具有統計學意義（P＞0.05）；中藥治療組低于模型組，但差異不具有統計學意義（P＞0.05）；中藥預防組低于模型組，差異具有統計學意義（P＜0.01）；中藥預防組相比治療組降低，差異具有統計學意義（P＜0.05）。結果見表4。

4 討論

目前MetS動物模型大多采用誘發性模型。根據誘發物質的不同分為食物誘發性模型、化學物質誘發性模型、喂養＋化學物質誘發性模型和外科手術干預模型等。相比其他幾種造模方法，食物誘發性模型的好處在于可模擬環境因素如限制其活動等，成模率較高，模型接近臨床，但造模時間較長，模型相對不穩定。本研究采用高脂高糖高鹽飲食8周誘導造模方法已經被我們課題組之前的研究[11-15]多次使用并驗證。造模和成模情況與其他課題組研究結果[16-18]一致。本實驗中大鼠經高脂高糖高鹽飼料喂養8周后，與正常組大鼠相比較，模型組大鼠IRI升高（P＜0.01），血脂 TC（P＜0.01）、TG（P＜0.05）、LDL（P＜0.01）升高，出現典型MetS組分，提示造模成功。第12周的中藥治療組、預防組與模型組相比，IRI、TC、TG、LDL均較模型組降低（P＜0.01）。中藥預防組與治療組相比，IRI、TC值均比治療組低（P＜0.05），LDL也降低（P＜0.01）；再次證實了柴芪湯對于MetS糖脂代謝和胰島素抵抗的調節作用。

表3 柴芪湯各組大鼠血清ICAM-1濃度（±s，n＝6）ng·L－1

表3 柴芪湯各組大鼠血清ICAM-1濃度（±s，n＝6）ng·L－1

時間 正常組 模型組 中藥預防組 中藥治療組第4周 42.29±3.75 57.76±5.31** 53.72±4.16**第8周 41.53±4.14 64.06±9.14** 52.67±11.81*△第12周 42.93±2.26 69.33±11.45** 54.47±9.18*△△ 65.63±6.48*＃

表4 柴芪湯各組大鼠血清VCAM-1濃度（±s，n＝6）μg·L－1

表4 柴芪湯各組大鼠血清VCAM-1濃度（±s，n＝6）μg·L－1

時間 正常組 模型組 中藥預防組 中藥治療組第4周 472.81±70.2 648.02±110.90** 563.22±61.01第8周 532.25±60.11 701.00±111.93** 620.47±123.67第12周 541.44±87.43 710.98±82.00** 575.87±29.32△△ 679.88±57.41**＃

ICAM-1和VCAM-1同屬免疫球蛋白家族。生理情況下ICAM-1不表達或呈低表達或狀態，當有炎癥反應發生，ICAM-1可在外界刺激下表達增強。VCAM-1出現晚于前者，可表達于經外界刺激而活化的內皮細胞表面，兩種黏附分子均參與炎癥反應。而血清ICAM-1和VCAM-1的濃度水平可以反應動脈內皮 ICAM-1和 VCAM-1的表達水平[19-20]。Davies等[21]研究表明，在動脈粥樣硬化發生過程的不同時期，內皮黏附分子的表達量也不同，其中ICAM-1、VCAM-1在脂紋期主要表達于動脈內皮細胞表面，可促進單核細胞向內皮細胞黏附，進入炎癥部位；而隨著病變的進展，黏附分子在內皮的表達逐漸減弱，而在纖維斑塊中其表達增強，提示 ICAM-1、VCAM-1是動脈粥樣硬化早期的病理變化及斑塊進展的潛在機制，并與硬化嚴重程度有關。多個研究[22-25]亦證實MetS患者的可溶性ICAM-1和VCAM-1水平明顯增高，其與MetS患者的動脈內皮損失、動脈粥樣硬化密切相關。本研究中模型組血清ICAM-1和VCAM-1比正常組的高，差異具有統計學意義，進一步證實了MetS的炎性機制。

關于柴芪湯對黏附分子的影響作用，實驗結果發現：4周末的模型組大鼠 ICAM-1已經開始升高，而中藥預防組的升高程度相比模型組較低，但差異不具統計學意義，而8周末及12周末的中藥預防組ICAM-1濃度的升高低于模型組，差異均具有統計學意義，說明柴芪湯對炎癥因子具有抑制作用，但中藥預防組的濃度相比正常組升高，而且差異具有統計學意義，說明單純的中藥預防可能無法完全祛除病因（高脂高鹽高糖飲食）；于第9周開始進行中藥治療的中藥治療組大鼠在第12周末的ICAM-1濃度的升高相比模型組較低，但差異無統計學意義，并且相比中藥預防組升高，差異具有統計學意義，出現這種結果的原因可能是MetS模型大鼠8周的造模使得血管內皮功能受損害程度較初期更為嚴重，后期的干預無法達到和前期預防相同的水平。3個時間點的模型組大鼠VCAM-1水平均較正常組升高，差異均具有統計學意義，第4周末和第8周末的中藥預防組的VCAM-1濃度的升高雖低于模型組，但差異無統計學意義，第12周末的中藥預防組的VCAM-1水平則明顯低于模型組（P＜0.01），考慮可能為本次實驗設定的中藥湯劑給藥濃度[26]不足以在前期（8周內）對VCAM-1的表達產生明顯抑制。在第12周末的中藥治療組出現了和ICAM-1水平相似的結果，筆者認為前期預防效果良好正是體現了中醫對MetS多種代謝異常聚集的疾病進行未病先治優勢所在，其通過調理脾胃運化功能以改善血管功能，延緩重要臟器血管疾病的發生。

代謝綜合征的中醫病名討論及對癥、辨證治療的相關研究仍處于以個人臨床經驗為主導的局面。本課題組認為脾失健運、肝失疏泄是代謝綜合征的核心病機，肝氣不舒、脾不散精、物不歸正則化為痰、濕、瘀等病理產物，積聚于重要臟器，可進一步發展為心腦血管疾病；這與MetS的整個病程發展密切相關。臨床上我們以疏肝健脾之柴芪湯對MetS患者進行干預，取得良好的療效。其中柴胡具有疏肝解郁的功效，是治療肝氣不舒的代表藥物，多種研究證實其具有抗炎作用[27]、其有效成分柴胡皂苷能抑制小鼠實驗性高脂血癥形成[28]。黃芪為補脾升陽的要藥，其補氣之力強，兼能通調水道，利濕驅邪。現代藥理研究顯示黃芪具有降糖作用[29]，還可顯著降低高血壓患者的炎癥遞質水平，有效防治和緩解動脈粥樣硬化癥狀[30]。關于白術的功用，研究發現白術的主要成分為蒼術酮、白術內酯及糖類，除了有利尿、抗炎的功效，還能減肥和降血糖[31]，與黃芪相配伍，可分別補益胸中及脾胃之氣。枳實善破氣除痞，化痰消積，其藥理作用也包括調節胃腸運動、降低膽固醇等，對高脂血癥患者的血脂及內皮功能有改善作用[32]。三七為活血化瘀止血的要藥，研究表明三七中的活性成分可通過抑制NF-κB和MAPK通路從而起到抗炎的作用[33]。三七中的活血成分三七總皂苷可促進纖維酶活性、抑制血小板聚集，并降低全血黏度，達到顯著抗凝的效果[34-35]。綜上，整個組方的特點為補氣理氣為主、疏肝健脾并重，兼以活血化瘀、祛濕燥痰，從整體對代謝綜合征尤其是證屬肝郁脾虛的進行綜合調理。

關于柴芪湯給藥時機，本實驗結果提示，自第9周起給藥的中藥治療組的黏附因子表達雖低于模型組但并不明顯，而自第1周開始給藥的預防組則顯現出升高程度明顯低于模型組的結果。筆者認為正是由于ICAM-1和VCAM-1在動脈粥樣硬化的初期主要表達在動脈內皮細胞表面，所以前期給藥預防的效果明顯優于后期干預，由此提示在臨床上對于心腦血管疾病高危人群，應予以高度警惕并根據中醫辨證進行適時干預，以延緩或減輕血管內皮病理改變從而達到防治MetS并降低心腦血管疾病風險的目的。