好要湯薄層鑒別及其鞣花酸含量測(cè)定研究△

鐘宇富，劉國(guó)洪，陳桂添，杜英娟，時(shí)軍*

（1.廣禾堂草本生物科技（上海）有限公司，上海 200233；2.廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006）

好要湯是一款具有緩解疲勞、促進(jìn)產(chǎn)后恢復(fù)的功能食品，源于婦科臨床補(bǔ)腎強(qiáng)腰方，含覆盆子、黃精、玉竹、酸棗仁等中藥，具有益氣扶正、補(bǔ)肝腎的功效，可提高人體精力，預(yù)防早衰，促進(jìn)人體各項(xiàng)生理功能恢復(fù)[1]。該功能食品用于產(chǎn)后虛弱、勞累過(guò)度的產(chǎn)婦，效果較好。為控制該產(chǎn)品質(zhì)量，建立了該制劑中覆盆子、酸棗仁、黃精的TLC定性鑒別方法，并采用HPLC法測(cè)定鞣花酸的含量。

1 材料

1.1 儀器材料

BSA124S型電子天平（德國(guó)賽多利斯公司）；REX-C700型恒溫六孔水浴鍋（江蘇金壇市金城國(guó)勝實(shí)驗(yàn)儀器廠）；ZF-20D暗箱式紫外分析儀（上海寶山顧村電光儀器廠）；202-2AB型電熱恒溫干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司）；雙槽玻璃層析缸（規(guī)格10 cm×10 cm）；玻璃點(diǎn)樣毛細(xì)管（上海申立玻璃儀器銷售有限公司，內(nèi)徑0.3 mm，管長(zhǎng)100 mm，硬質(zhì)中性玻璃）；顯色噴霧瓶（上海信誼儀器廠有限公司，021-59331359）；硅膠G薄層板（德國(guó)默克公司，規(guī)格10 cm×10 cm，厚度0.25 mm）；硅膠G薄層板（青島海洋化工廠分廠，規(guī)格10 cm×20 cm，厚度0.20～0.25 mm）。

1.2 試劑和藥品

好要湯（廣禾堂草本生物科技（上海）有限公司，批號(hào)：170423、170521、170617）；覆盆子對(duì)照藥材、酸棗仁對(duì)照藥材、黃精對(duì)照藥材（中國(guó)食品藥品檢定研究院，供薄層鑒別用）；鞣花酸對(duì)照品（上海同田生物技術(shù)有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)：＞98%，批號(hào)：11053121）；椴樹(shù)苷對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：112000-201501）；酸棗仁皂苷 A對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110734-201507）；香蘭素（天津市福晨化學(xué)試劑廠）；甲醇、無(wú)水乙醇（分析純，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司）；正丁醇（分析純，上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；冰醋酸（分析純，天津市百世化工有限公司）；乙酸乙酯、氯仿、石油醚、甲酸、濃硫酸（分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠）；蒸餾水（廣州屈臣氏食品飲料公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 覆盆子薄層鑒別

參考文獻(xiàn)方法[2]，取本品3 g，置于150 mL錐形瓶中，加甲醇50 mL，超聲提取30 min，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)? mL乙醇溶解，作為供試品溶液。制備不含覆盆子的產(chǎn)品，按前法同樣操作，作為陰性對(duì)照樣品溶液。精密稱取椴樹(shù)苷對(duì)照品6 mg，用6 mL乙醇溶解制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。取覆盆子對(duì)照藥材1 g，置于研缽中研碎，放置于150 mL錐形瓶中，加甲醇50 mL，超聲提取30 min，過(guò)濾，濾液蒸干，殘?jiān)? mL乙醇溶解，作為對(duì)照藥材溶液[1]。取硅膠 G薄層板，于105℃活化30 min后，分別吸取上述椴樹(shù)苷對(duì)照品溶液、覆盆子對(duì)照藥材溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照樣品溶液點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-甲醇-水（22∶1∶1）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，晾干，噴以0.5%三氯化鋁乙醇溶液，晾干，置于紫外光燈（365 nm）下檢視。與對(duì)照品與對(duì)照藥材對(duì)應(yīng)處，供試品顯示同樣顏色的斑點(diǎn)，見(jiàn)圖1。

圖1 覆盆子薄層鑒別色譜圖

2.2 酸棗仁薄層鑒別

參考文獻(xiàn)方法[3]，取本品5 g，加氯仿80 mL，回流提取2 h，棄去氯仿溶液，藥渣揮干，殘?jiān)偌尤爰状?00 mL，回流提取3 h，濾液蒸干，殘?jiān)? mL甲醇溶解，作為供試品溶液。制備不含酸棗仁的產(chǎn)品，按前法同樣操作，作為陰性對(duì)照樣品溶液。精密稱取酸棗仁皂苷A對(duì)照品5 mg，用5 mL乙醇溶解制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。取酸棗仁對(duì)照藥材1 g，加甲醇30 mL，加熱回流1 h，濾過(guò)，留濾液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL溶解，作為對(duì)照藥材溶液[2]。取硅膠G薄層板，于105℃活化30 min后，分別吸取上述酸棗仁皂苷A對(duì)照品溶液、酸棗仁對(duì)照藥材溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照樣品溶液點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以正丁醇-冰醋酸-水（4∶1∶5）的上層液為展開(kāi)劑，展開(kāi)，晾干，噴以2%香草醛硫酸乙醇溶液，80℃均勻受熱，觀察顯色斑點(diǎn)。與對(duì)照品與對(duì)照藥材對(duì)應(yīng)處，供試品顯示同樣顏色斑點(diǎn)，見(jiàn)圖2。

圖2 酸棗仁薄層鑒別色譜圖

2.3 黃精薄層鑒別

取本品3 g，加70%乙醇40 mL，加熱回流1 h，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0 mL溶解，然后加正丁醇振搖提取2次，每次20 mL，合并正丁醇液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL溶解，作為供試品溶液。制備不含黃精的產(chǎn)品，按前法同樣操作，作為陰性對(duì)照樣品溶液。稱取黃精對(duì)照藥材1 g，加70%乙醇40 mL，加熱回流1 h，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0 mL溶解，然后加正丁醇振搖提取2次，每次20 mL，合并正丁醇液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL溶解，作為對(duì)照藥材溶液[4]。取硅膠G薄層板，于105℃活化30 min后，分別吸取上述黃精對(duì)照藥材溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照樣品溶液點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以石油醚-乙酸乙酯-冰醋酸（12∶2∶0.1）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，晾干，噴以2%香草醛硫酸乙醇溶液，90℃均勻受熱，觀察顯色斑點(diǎn)。與對(duì)照藥材對(duì)應(yīng)處，供試品顯示同樣顏色斑點(diǎn)，見(jiàn)圖3。

圖3 黃精薄層鑒別色譜圖

2.4 鞣花酸含量測(cè)定

2.4.1 色譜條件 色譜柱：Cosmosil Cl8柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：甲醇（A）-磷酸水溶液（pH＝2.5，B），梯度洗脫（0～15 min，20% ～55%A；15～25 min，55%A）；流速：1.0 mL·min－1；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；進(jìn)樣量10μL；柱溫：30℃[5]。

2.4.2 溶液的制備 精密稱取鞣花酸對(duì)照樣品0.003 8 g，置于25 mL容量瓶中，用純甲醇定容，作為濃度為152μg·mL－1的對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密稱取顆粒0.4 g，置于10 mL容量瓶中，加入70%甲醇，超聲處理40 min，搖勻后靜置，取上清液，即得。精密稱取陰性對(duì)照品顆粒（不含覆盆子）0.4 g，置于10 mL容量瓶中，加入70%甲醇，超聲處理40 min，搖勻后靜置，取上清液，即得。

2.4.3 系統(tǒng)的適應(yīng)性與專屬性 取供試品溶液（170617批次）連續(xù)進(jìn)6針，進(jìn)樣后HPLC色譜圖，對(duì)照品和供試品中鞣花酸的保留時(shí)間一致，陰性對(duì)照無(wú)干擾見(jiàn)圖4。

圖4 好要湯專屬性考察圖譜

2.4.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性范圍 精密吸取鞣花酸對(duì)照品儲(chǔ)備液0.05、0.1、0.2、0.4、0.8 mL，分別用甲醇依次稀釋為 7.6、15.2、30.4、60.8、121.6μg·mL－1等系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。按色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，以鞣花酸濃度C為橫坐標(biāo)（X），以峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行線性回歸。得線性方程Y＝2.109 2X－10.102，r＝0.999 4，表明鞣花酸濃度在7.6～121.6μg·mL－1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取鞣花酸對(duì)照品溶液10μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果峰面積RSD值為0.50%，表明鞣花酸測(cè)定精密度良好。

2.4.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密稱取好要湯樣品（170617批次）0.4 g，按2.4.2供試品溶液的制備方法制備，按2.4.1色譜條件進(jìn)樣分析，分別于0、1、2、4、6、12、24 h進(jìn)樣分析，記錄鞣花酸峰面積，結(jié)果峰面積RSD值為0.60%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.7 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取好要湯樣品（170617批次）0.4 g，共6份，按2.4.2供試品溶液的制備方法制備，按2.4.1色譜條件進(jìn)樣分析，結(jié)果鞣花酸含量RSD值為2.01%。

2.4.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量的同一批好要湯樣品（170617批次）6份，每份約0.20 g，分別加入152μg·mL－1對(duì)照品溶液0.9 mL，按照2.4.2制備方法制備供試品溶液。進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4.9 樣品含量測(cè)定 精密稱取好要湯3批產(chǎn)品，每份0.4 g，按2.4.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣分析，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 不同批次好要湯中鞣花酸含量測(cè)定

3 討論

覆盆子主要成分有鞣質(zhì)、萜類、黃酮等，藥理作用主要有抗誘變、改善學(xué)習(xí)記憶能力、延緩衰老、增強(qiáng)免疫，對(duì)性腺軸有調(diào)控作用等[6-7]。鞣花酸為覆盆子中鞣質(zhì)的主要成分，具有良好的抗炎、抗誘變和抗菌作用等[8-9]。因此本實(shí)驗(yàn)選用鞣花酸作為質(zhì)量檢測(cè)成分。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)鞣花酸HPLC測(cè)定的藥典方法進(jìn)行考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙腈-0.2%磷酸等度洗脫時(shí)，基線漂移較嚴(yán)重，鞣花酸分離效果不佳，改用梯度洗脫（0～15 min，20% ～55%A；15～25 min，55%A），鞣花酸出峰時(shí)間在17 min左右，分離度好，靈敏度高。