全基因組測序技術應用于500例高危孕婦產前診斷的結果分析

黃寧 劉艷秋 丁書軍

江西省婦幼保健院產前診斷中心（南昌330006）

我國是出生缺陷高發國家之一，出生缺陷給社會和家庭帶來沉重的負擔，如何進行高效的產前診斷，減少出生缺陷的發生仍是很多產前診斷專家的重點關注領域。近年來隨著測序成本的不斷降低，數據分析水平的不斷提高，全基因組測序（whole-genome sequencing，WGS）已在腫瘤的診斷、治療及預后，復雜性疾病特別是兒童罕見遺傳病的診斷上得到運用，并逐步走向臨床，但在產前診斷領域的應用報道較少。本文將研究WGS技術在產前診斷染色體病方面的診斷價值。WGS無需細胞培養，能夠在較短時間內對全基因組水平進行掃描，可檢測染色體拷貝數變異，尤其在微小結構異常檢出方面具有無可比擬的優勢。

1 對象與方法

1.1 研究對象選取自2017年3月至2017年12月期間在江西省婦幼保健院就診并接受產前診斷孕婦500例，其中羊水產前診斷370例，臍血產前診斷130例。產前診斷指征包括高齡、唐篩高危、無創產前檢測陽性、B超檢查胎兒發育異常、夫婦一方染色體異常及異常產史，這些孕婦均經知情選擇，同意進行產前診斷。

1.2 研究方法所有孕婦均進行遺傳咨詢，簽署了產前診斷知情同意書，明確了產前診斷流程、羊水或臍血全基因組測序分析和染色體核型分析的目的意義、局限性及出現不明意義結果的可能性，詳細記錄孕產史、家族史、末次月經及個人基本信息等資料，依據孕周不同，分別進行羊膜腔穿刺術和臍帶血穿刺術，所有羊水和臍血標本同時進行全基因組測序拷貝數變異分析和細胞培養染色體核型分析。此項研究獲得江西省婦幼保健院倫理委員會同意。

2 結果

2.1 產前診斷適應癥及結果分布共計500例孕婦接受產前診斷，其中75%為B超檢測胎兒發育異常和胎兒無創DNA陽性，檢出異常病例71例，429例未見異常。71例異常病例中，B超胎兒發育異常者檢出29例，其中21三體8例，18三體3例，13三體2例，45，X檢出1例，臂間倒位4例，非平衡性染色體結構異常4例，染色體微缺失微重復5例，嵌合體2例；無創產前檢測異常者檢出27例，其中21三體2例，18三體1例，性染色體數目異常14例，臂間倒位2例，非平衡性染色體結構異常3例，染色體微缺失微重復3例，嵌合體2例；異常孕產史者檢出2例，1例為非平衡性染色體結構異常，1例為染色體微重復；唐篩高危者檢出3例，2例為臂間倒位，1例為染色體微重復，提示疑似致病變異；夫婦一方染色體異常者檢出異常10例，均為親代來源的臂間倒位和染色體平衡易位。見表1。

表1 不同適應癥產前診斷結果分布Tab.1 Pregnant diagnosis of different indications 例（%）

2.2 異常檢出結果500例WGS和胎兒細胞培養染色體核型分析成功率100%，檢出異常染色體71例，異常率14.2%。其中胎兒細胞染色體核型分析檢出61例異常核型，異常率12.2%（61/500），包括21三體10例，18三體4例，13三體2例，性染色體數目異常15例，平衡易位8例，染色體倒位10例，嵌合體4例，非平衡性染色體結構異常8例；另WGS檢出10例微缺失微重復病例。

3 討論

新一代測序技術（next-generation sequencing，NGS）的飛速發展不僅大幅減少了基因組檢測費用，還縮短了檢驗時長，能有效為檢測對象提供快速、全面的報告。全基因組測序作為一項準確性高、全面覆蓋性好、經濟有效的檢測手段，勢必會改變當前人類健康檢驗模式［1］。當前NGS已在腫瘤診斷、治療和預后等領域發生了深刻的變化，很多腫瘤中心正在考慮將全基因組測序或全外顯子測序技術廣泛應用于臨床［2-3］。在產前檢測領域，應用NGS技術進行無創性產前非整倍體檢測（noninvasive prenatal testing for aneuploidy，NIPT）已在國內推廣使用［4］。臨床上已將WGS和全外顯子測序（WES）用于罕見遺傳性疾病診斷，尤其是一些兒童疑難復雜疾病的實驗室診斷［5-7］。已有研究表明，基于多種分析策略及多種測序平臺的應用，均證實WGS技術的高效性和實用性［8-9］。

本文中500例產前診斷孕婦，染色體病異常檢出率為14.2%（71/500），其中WGS在染色體非整倍體檢出的基礎上，又檢出10例染色體微缺失微重復病例，相對于傳統染色體核型分析技術，提高了2%（10/500）檢出率。如果沒有運用WGS這一技術，那么將會大大限制產前診斷的檢測潛能，一部分拷貝數變異（copy number variants，CNVs）將無法檢出，這些胎兒將會出現嚴重殘疾。這一結果表明WGS技術相較于染色體核型分析，具有進一步提高產前診斷中致死致殘嚴重染色體病的檢出潛能。

傳統400條帶G顯帶染色體核型分析分辨水平在10 M左右，而WGS的檢測能力可達到100 Kb水平，這一技術優勢是細胞學技術無法比擬的。WGS不僅可以檢測微小CNVs，還可以判斷不明來源染色體片段或結構。一例臍血病例中，B超提示胎兒頸部囊腫，染色體核型分析46，XN，add（6）（q27），即6號染色體長臂末端附著一未知來源染色體片段。該例孕婦同時進行了WGS檢測，提示有一個大小為2.99 Mb的缺失存在于6q27和一個39.06 Mb大小的重復存在于10p11.1p15.3，均為已知致病變異［10-11］。考慮到該例孕婦孕周已達25周，臍血穿刺后兩周即出具了診斷報告，沒有等待夫婦外周血染色體比對分析，有助于孕婦及其家屬盡早抉擇。

眾所周知，染色體核型分析受人員、技術、細胞質量等多因素影響，分辨水平受制片質量影響較大，即使一些400條帶水平小的結構異常也容易被忽略，而WGS正好可以彌補這一缺陷。一例羊水病例中，該名孕婦既往生育一胎，多發畸形而夭折，染色體核型分析46，XN，9p 22，即9號染色體短臂末端缺少一條深帶，其他染色體無異常，考慮為9號染色體部分單體；WGS提示有一個19.05 Mb大小的缺失位于9p22.1p24.3，一個8.85 Mb大小的重復位于20p12.3p13，結合兩者分析結果判斷該孕婦核型為 46，XN，der（9）t（9；20）（p22；p13），及時對孕婦進行知情告知，并進行了夫婦外周血染色體比對，證實為父系遺傳。

在10例微缺失微重復病例中檢出2例為疑似致病變異，1例孕婦24歲，無創產前檢測10號染色體微重復，羊水WGS提示46，XN，dup（10q22.3q23.2），重復片段大小為7.43 Mb，1例孕婦36歲，唐篩18三體高風險，羊水WGS提示46，XN，dup（2q13），重復片段大小為1.77 Mb。此兩例均為新發突變，有研究［12-13］表明10q22.3q23.2區域的重復變異可能導致表型變異，有研究［14-15］表明2q13區域的重復變異為致病變異，但個體間臨床表現具有差異性，還需結合臨床做進一步分析。目前這兩例病例仍在繼續妊娠，B超檢測無異常，我們將會密切隨訪關注。另8例CNV病例中5例為B超檢測胎兒發育異常，2例無創產前檢測陽性，1例孕婦為異常孕產史，均提示為明確致病，檢出異常變異最小僅為640.49 kb。此8例孕婦在充分知情告知后均選擇終止妊娠。

當前WGS沒有作為一項常規檢測運用于臨床，受技術水平和遺傳咨詢能力所限，特別是在一些基層醫療單位難以開展。相對于傳統染色體核型分析，WGS對產前診斷檢測潛能有較大的提升，尤其在一些微缺失微重復綜合征的檢測方面。但同時也會有部分病例增加遺傳咨詢難度。