結核感染T細胞斑點試驗在結核病診斷中的價值及影響因素

夏青 桂淑玉 韓莙

安徽醫科大學第一附屬醫院呼吸與危重癥學科（合肥230022）

我國是世界上22個結核病高發國家之一，每年因結核病死亡病例達13萬例。結核病是一種慢性傳染病，其致病菌為結核分枝桿菌。結核分枝桿菌能夠侵犯機體的多個臟器，最常見的是肺結核，這些疾病都會對人體造成極大的危害。結核分枝桿菌感染后的臨床癥狀相當復雜，特別是肺外結核感染，其臨床表現較為隱匿，癥狀不典型，常常容易導致誤診、漏診。因此，如何能夠快速、準確的診斷結核病，有效的控制結核病的繼續蔓延，已經成為公共衛生需要重視的問題。現代醫學對于結核病的診斷多是在臨床癥狀的基礎上，結合結核菌培養、抗酸桿菌涂片、X線檢查、結核菌素試驗及血清TB-Ab結果進行確診。但因所需時間長、敏感度低、假陽性高、假陰性高等問題，不能及時、有效的診斷結核病，耽誤患者病情。近年來研究人員發現，人體內的效應T細胞［1］再次被暴露的抗原刺激，會在體外釋放γ干擾素。基于這一研究發現，國外學者提出T-SPOT.TB檢測法，利用結核特異抗原ESAT-6及CFP-10，通過酶聯免疫斑點技術ELISPOT檢測受試者體內是否存在結核效應T淋巴細胞，從而判斷目前該受試者是否感染結核桿菌。該檢測手段具有靈敏度高、特異性強等優點。但T-SPOT.TB仍存在一定的假陽性率和假陰性率，很少有報告探討T-SPOT.TB的影響因素。本研究通過對我院疑似結核病患者325例進行T-SPOT.TB、PPD和血清TB-Ab檢查，分別研究其對結核病診斷的敏感度、特異性、假陽性率和假陰性率，探討其在結核病診斷中的價值，并研究患者性別、年齡及血液中各項指標對T-SPOT.TB的影響，現報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集我院2015年1月至2017年5月住院期間的疑似結核病患者325例，其中男224例，女101例，年齡8～95歲，平均（50.11±19.83）歲。納入標準：有咳嗽、咳痰、午后低熱或咯血等癥狀，胸部X線或相應部位影像學檢查異常，排除AIDS感染、急性病毒感染、應用免疫抑制劑、妊娠等免疫功能影響患者。按照最終確診結果分為結核性疾病組和非結核性疾病組。其中，結核性疾病組254例，非結核性疾病組71例。結核性疾病組納入標準（滿足任意一項）：（1）涂片抗酸桿菌或分枝桿菌培養陽性；（2）病理活檢提示結核；（3）臨床表現和影像學表現符合典型結核性改變，且抗結核治療有效。非結核性疾病組納入標準（滿足任意一項）：（1）病理檢查明確腫瘤并排除結核分枝桿菌感染；（2）病理檢查確定為其他病原體感染；（3）抗結核治療無效，經其他非抗結核治療有效。

1.2 儀器和試劑HealForce培養箱、T-SPOT.TB試劑盒采購于英國Oxford Immunote Ltd公司；酶聯免疫熒光斑點分析儀采購于德國AID公司；淋巴細胞分離液、Gibco AIM-V、Gibco RPMI 1640細胞培養液采購于上海復星長征醫學科學有限公司。

1.3 實驗操作程序

1.3.1 T-SPOT.TB結果判斷T-SPOT.TB實驗結果包括陰性對照，陽性對照，抗原A和抗原B。（1）實驗有效的標準：陰性對照孔內斑點形成細胞計數＜10個，且陽性對照孔內斑點形成細胞計數＞20個。（2）陽性結果判斷標準：①陰性對照孔斑點數為＜6個，且（抗原A或抗原B孔的斑點數）-（陰性對照孔斑點數）＞6個；②陰性對照孔斑點數為＞6個，且（抗原A或抗原B孔的斑點數）＞2倍（陰性對照孔斑點數）。滿足陽性結果判斷標準任意一條均為陽性，否則為陰性［2］。

1.3.2 PPD結果判斷硬結平均直徑＜5 mm為陰性，直徑范圍5～9 mm為弱陽性，10～19 mm為陽性，≥20 mm或雖＜20 mm但局部出現水泡和淋巴管炎為強陽性反應［3］。

1.3.3 血清結核抗體檢測采用膠體金法，試劑由南京大淵生物技術工程有限責任公司提供。

1.3.4 NLR、PLR計算選擇患者入院時血常規、白蛋白檢測結果，并計算NLR、PLR。

1.4 統計學方法采用SPSS 22.0統計學軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差表示，進行t檢驗。計數資料以率表示，用χ2檢驗。應用logistics回歸分析評估性別、年齡、血常規及白蛋白對T-SPOT.TB的影響，P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 臨床診斷結果325例疑似結核病患者中，確診為活動性結核病254例，包括肺結核（包括肺結核合并肺外結核）230例、肺外結核（包括結核性胸腔積液、骨結核、結核性腦膜炎、乳房結核、淋巴結結核等）24例，非結核病患者71例（包括肺炎、支氣管擴張、肺癌、塵肺、肺膿腫、間質性肺炎等）。

2.2 各組患者T-SPOT.TB試驗結果T-SPOT.TB試驗結果顯示，活動性結核病254例患者，陽性有200例，敏感度 78.74%（200/254），假陰性率21.26%（54/254）；非結核性疾病患者71例，陰性患者有54例，特異性76.06%（54/71），假陽性率23.94%（17/71），見表1。

表1 各組患者T-SPOT.TB試驗結果Tab.1 T-SPOT.TB test results of patients in each group例（%）

2.3 各組患者PPD試驗結果PPD診斷活動性結核病的敏感度為54.72%（139/254），特異性為71.83%（51/71），假陽性率為28.17%（20/71），假陰性率為45.28%（115/254）。見表2。

2.4 各組患者血清TB-Ab試驗結果血清TB-Ab診斷活動性結核病的敏感度為40.94%（104/254），特異性為77.46%（55/71），假陽性率為22.54%（16/71），假陰性率為59.06%（150/254）。見表3。

表2 不同類型患者PPD實驗結果Tab.2 PPD experimental results of different types of patients例（%）

表3 不同類型患者血清TB-Ab實驗結果Tab.3 SerumTB-Ab test results of different types of patients例（%）

2.5 對活動性結核病組、非結核病組分別進行TSPOT.TB、PPD試驗和血清TB-Ab三種方法檢測三種方法對結核病和非結核病的檢出差異均具有統計學意義（均P＜0.05），見表4。

表4 三種檢測方法分別在結核病組、非結核病組的比較Tab.4 Comparison of the three detection methods in the nontb group in the tuberculosis group

2.6 三種檢測方法在結核病診斷方面比較差異具有統計學意義（χ2=90.00，P＜0.001），見表5。

表5 三種檢測方法對結核病檢出率的比較Tab.5 Comparison of TB detection rates between the three detection methods

2.7 Logistics回歸分析性別、年齡、白細胞計數、淋巴細胞絕對值、中性粒細胞絕對值、血小板計數、血紅蛋白、白蛋白、PLR、NLR對T-SPOT.TB的影響。回歸分析過程中，中性粒細胞和血小板未通過模型顯著性檢驗。性別、年齡對T-SPOT.TB無顯著性影響（P＞0.05）。白細胞對T-SPOT.TB系數為0.158，但白細胞對T-SPOT.TB無顯著性影響（P＞0.05）。淋巴細胞與T-SPOT.TB呈正相關（r=10.53，P＜0.05）。血紅蛋白和白蛋白對TSPOT.TB無顯著性影響（P＞0.05）。NLR與T-SPOT.TB呈負相關（r=-2.146，P＜0.05），PLR與T-SPOT.TB呈負相關（r=-0.125，P＜ 0.05）（表6、7）。

3 討論

結核病仍然是本世紀嚴重危害人類健康的主要傳染病之一，具有傳染性強、發病率高、隱匿性強和臨床癥狀不典型等特點，是全球關注的公共衛生和社會問題。世界衛生組織統計，每年約有900萬例新發的結核感染病例，特別是肺結核［4］。現如今，世界衛生組織把印度、中國、俄羅斯、南非、秘魯等22個國家列為結核病高負擔、高危險國家，全球80%的結核病例集中在這些國家，嚴重影響了這些國家人民的生存質量。因此早期、快速準確診斷結核病，是目前發展中國家防治結核發生的重要工作。

傳統意義上，進行結核病原學［5］的檢查是診斷結核病的金標準。但病理學檢查對患者造成較大的創傷，臨床實施具有一定的困難，常規的結核菌培養需要時間較長，培養條件比較高，而且受到標本質量和結核菌數量的影響，假陰性率較高，痰涂片檢出率也相對較低。因此，在臨床診斷中，病原學檢查的方法并不普及。目前，臨床上多采用結核菌素試驗（PPD）［6］，結核菌素試驗是一種臨床廣泛常用的結核篩查方法，向患者皮下注入結核菌素，通過主動免疫，注射后48～72 h內密切關注硬結大小，最后將硬結大小與不同標準進行比較，得出判斷結果。該方法具有操作簡單，檢測快速等優點，常作為診斷性抗結核治療的實驗室檢查依據。但由于我國人群卡介苗接種率較高，存在PPD假陽性率較高的情況，并且機體自身免疫狀態很容易影響PPD試驗的結果，這一缺點嚴重限制了該方法在臨床上的應用。血清TB-Ab操作簡單，檢測快速，常被臨床采用，但溶血樣本和高脂血樣本不宜，且易受免疫功能影響，疾病急性感染的早期，易出現陰性結果，假陰性率較高（本試驗中，假陰性率達59.06%），敏感度低，臨床應用價值有限。這些問題的存在，嚴重限制了結核病的準確診斷和有效治療。

表6 各指標對T-SPOT.TB的影響Tab.6 Influence of each indicator on T-SPOT.TB

表7 各指標對T-SPOT.TB的影響Tab.7 Influence of each indicator on T-SPOT.TB

近年來，T-SPOT.TB試驗憑借其在診斷結核分枝桿菌感染方面具有敏感性高、特異性強的特點，被逐漸推廣，用來診斷結核桿菌感染。自2006年該方法被相關部門認證，越來越多的研究證明該方法的優勢。T-SPOT.TB是由酶聯免疫斑點［7］發展而來的檢測結核疾病的新型方法。T-SPOT.TB對T淋巴細胞的反應十分靈敏，其作用機理是通過檢測是否存在結核感染T淋巴細胞后分泌的特異性細胞因子干擾素γ來明確患者有無結核感染。多項研究表明［8-11］，T-SPOT.TB對于診斷結核病的敏感度和特異性較高，同時T-SPOT.TB的敏感性不會受到機體免疫狀態的影響。隨著近些年對T-SPOT.TB的研究發現，該方法在檢測活動性結核病時，對機體狀態的影響小。當結核分枝桿菌被清除后，機體內的效應T細胞就會立即消失，因此，T-SPOT.TB試驗不僅適用于結核分枝桿菌感染患者，也能很好的反映患者的預后情況，還有利于胸腔積液內單個核細胞的檢測，能夠更加靈敏、準確地反應胸腔結核分枝桿菌感染的情況。本研究結果表示，對于鑒別結核病和非結核病，T-SPOT.TB、PPD試驗和血清TB-Ab差異均有統計學意義（P＜0.001），同時，在比較T-SPOT.TB、PPD試驗和血清TB-Ab對結核病的診斷效果時，本研究通過不同類型的結核病，比較各自的敏感度、假陽性率、假陰性率等結果發現，在抗酸桿菌涂片、結核分枝桿菌病原學檢查等手段［12］確診的結核患者中，T-SPOT.TB的敏感度（78.74%）明顯高于PPD試驗、血清TB-Ab（P＜0.001），且特異性（76.06%）高。

但T-SPOT.TB仍存在假陽性率23.94%、假陰性率21.26%。本研究中，男224例，女101例，年齡8～95歲，性別及年齡對T-SPOT.TB均無顯著性影響，血紅蛋白和白蛋白對T-SPOT.TB無顯著性影響。說明老年患者、貧血患者或者低蛋白血癥患者，雖免疫功能低下，對T-SPOT.TB結果影響較小。與以前的多項研究［13-14］一致。

結核病主要的免疫保護機制是細胞免疫，淋巴細胞是主要的免疫調控細胞。當人體受結核分枝桿菌的感染，巨噬細胞立即作出反應，大量分泌白細胞介素-1和腫瘤壞死因子等細胞因子使淋巴細胞聚集到結核分枝桿菌入侵部位，逐漸形成肉芽腫，限制并殺滅結核分枝桿菌。本研究中，淋巴細胞對T-SPOT有顯著性正向影響，淋巴細胞升高，易引起特異性免疫反應。中性粒細胞具有很強的趨化作用和吞噬能力，當局部發生感染時，中性粒細胞可以快速穿越血管內皮細胞進入受侵部位，對感染的病原體發揮吞噬功能和清除作用，它可以調節淋巴細胞活性［15］，血小板是凝血的重要因子，在免疫調節中作用顯著［16］，NLR、PLR作為炎癥標志物，反映體內炎癥細胞因子水平，已被用于不同腫瘤疾病和炎癥疾病中的分期及預后影響因素［17-21］。本研究中，NLR、PLR對T-SPOT.TB均有顯著性負向影響。因此，對疑似結核病患者進行T-SPOT.TB檢測時，尚需考慮此患者的淋巴細胞絕對值、NLR及PLR對檢測結果的影響。但本研究數據偏少，應繼續擴大樣本量加以研究。

綜上所述，T-SPOT.TB對結核病診斷有較高的敏感度和特異性，抽血24 h后便能得出診斷結果，準確、快捷。但是該試驗也存在一些技術和其他方面的問題。目前臨床上利用該方法檢測結核分枝桿菌的費用比較昂貴，并且操作步驟比較繁瑣，對實驗室的技術要求也比較高，受淋巴細胞、NLR、PLR的影響較大，需綜合分析其試驗結果。但其在診斷結核感染方面有突出的優勢，因此，臨床上有疑似結核感染的患者進行T-SPOT.TB檢測，無疑可減少結核感染的漏診，也值得臨床應用和推廣。