奶牛乳房炎源金黃色葡萄球菌耐藥性研究進展

趙艷坤 劉慧敏 王帥 蔡建星 王成 陳賀

（1. 新疆農業科學院農業質量標準與檢測技術研究所 農業農村部農產品質量安全風險評估實驗室 新疆農產品質量安全實驗室，烏魯木齊830091；2. 農業農村部農產品質量安全風險評估實驗室，北京 100193）

金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus，S.aureus）是一種革蘭氏陽性菌，在世界范圍內被稱為侵襲性病原菌，是引起奶牛乳房炎的重要致病菌之一，感染率達50%以上［1］。S.aureus性乳房炎主要致病機理是侵入奶牛乳腺組織后，定殖和黏附于乳腺上皮 細 胞（Mammary epithelial cells，MECs）［2］， 損害MECs和腺泡功能［3］，還可出現乳腺膿腫、硬化或瘺管，嚴重者會出現乳腺的壞死和脫落，一旦感染很難治愈［4］，不僅影響產奶量和乳品質，造成巨大經濟損失，甚至危及人類健康。近年來，隨著抗菌藥物在臨床和畜牧業的濫用，S.aureus耐藥性問題日趨嚴重，出現了多重耐藥（Multidrug-resistant，MDR）菌株及超級細菌-耐甲氧西林金黃色葡萄球 菌（Methicillin-resistantStaphylococcus aureus，MRSA），其MDR和泛耐藥（Pan-drug resisitance，PDR）引起了國內外專家學者廣泛關注［5］。據報道，全球MRSA的檢出率為18.4%-82.9%，我國MRSA平均檢出率為47.9%［6］，MRSA 90%以上是MDR菌株［7］。目前，細菌耐藥性問題已成為全世界共同關注的焦點，中國政府也十分重視抗菌藥物臨床合理使用和細菌耐藥問題。2018年，為貫徹十九大精神，全國堅持實施優質乳工程，而在十三屆全國人大一次會議中，農業部表示將狠抓細菌耐藥性問題。現階段，在抗菌藥物選擇的壓力下，新的S.aureus耐藥機制不斷出現，且伴隨著耐藥基因在菌體間的轉移，使得S.aureus性奶牛乳房炎難以使用1種抗菌藥物或不同化學成分的抗菌藥物聯合治療。目前，乳制品和獸醫業對奶牛臨床治療的現狀要求限制S.aureus耐藥性傳播，并迫切需要開發不被現有耐藥機制覆蓋的新抗菌藥物。因此，本文分析S.aureus耐藥性現狀，并結合S.aureus耐藥基因以闡明其耐藥機制，旨為S.aureus性奶牛乳房炎臨床治療用藥及新型藥物研發提供理論參考，同時響應十九大精神對整個奶牛養殖業的綠色健康發展具有重大意義。

1 奶牛乳房炎金黃色葡萄球菌耐藥現狀

S.aureus產生耐藥的根本原因是抗菌藥物的大量使用，且抗菌藥物使用時間越長，其越容易產生耐藥性，兩者呈正相關［8］。丹麥于1963年最早發現了人類耐甲氧西林且mec基因陽性的金黃色葡萄球菌菌株（Methicillin-resistantStaphylococcus aureus，MRSA）［9］。1975年，比利時首次從奶牛乳房炎中分離出MRSA［10］。近年來，隨著S.aureus和MRSA的流行傳播，其泛耐藥性給奶牛養殖業帶來嚴重的威脅，因此在全球備受關注。

1.1 國外奶牛乳房炎源S.aureus耐藥現狀

S.aureus具有廣譜耐藥和多種耐藥特性（表1）。2011-2018年近10年的統計數據可以看出，國外對奶牛乳房炎中S.aureus、MRSA的分離率因地域性差異浮動較大，2011-2014年MRSA的分離率不是很高，但近幾年有增加的趨勢；S.aureus對β-內酰胺類、氨基糖苷類、喹諾酮類及大環內酯類等常見類型抗菌藥物表現不同程度的耐藥，耐藥性變化趨勢為：β-內酰胺類、磺胺類、四環素類及氨基糖苷類耐藥性明顯上升；大環內酯類略有上升；喹諾酮類耐藥性沒有明顯變化。值得一提的是，2015年南非西北部發現S.aureus對萬古霉素的耐藥率高達68.79%；2018年，阿拉伯北部發現S.aureus對氯霉素耐藥率達13.7%，而在此之前對其均表現敏感，說明S.aureus耐藥菌株逐漸增多，但其區域性差異巨大。同時，奶牛乳房炎S.aureus的MDR（30.9%-100%）現象嚴重，近兩年分離的S.aureus均為MDR（100%）。

1.2 國內奶牛乳房炎源S.aureus耐藥現狀

查閱近年來我國奶牛主要養殖區域或乳房炎高發地區的S.aureus耐藥性相關資料并進行整理，總結我國各地區耐藥率高低如下：新疆：PG＞AMP＞ERY＞ 克林霉素（Clindamycin，CLI）＞TET＞SXT；內蒙古：ATM＞氧氟沙星（Ofloxacin，OFX）＞AMP＞SXT＞ERY；寧夏：PG＞AMP＞ERY＞SXT；天津：PG＞CEF＞ERY＞TET＞ 甲氧西林（Methoxicillin，MET）＞CLI＞林可霉素（Lincomycin，LNY）；河北：磺胺異惡唑（Sulfonazo isoxazole，SIZ）＞AMP＞甲氧胺嘧啶（Methoxamine pyrimidine，TMP）＞SXT＞阿 莫 西 林（Amoxicillin，AMC）＞強力霉素（Doxycycline，DO）＞ERY＞克拉霉素（Clarithromycin，CLR）＞LNY＞阿奇霉素（Azithromycin，AZM）；山東：PEN＞諾氟沙星（Norfloxacin，NOR）＞恩諾沙星（Enrofloxacin，ENR）＞卡那霉素（Kanamycin，K）＞鏈霉素（Streptomycin，SM）＞GM＞ERY；黑龍江：PG＞AMP＞SXT；江蘇：PG＞AMP＞SXT＞SM＞K＞ERY＞TET＞CLI；上海 ：PG＞AMP＞SXT＞ERY ； 安 徽 ：PG＞AMP＞SXT＞ERY＞CLI；浙江：PEN＞AMP＞SXT；河南：PG＞AM0＞AMP＞SXT；陜西：PG＞AM0＞AMP＞SM。假設同一地區大于70%的S.aureus分離株對某種藥物敏感度認定為該區S.aureus菌株對此藥敏感，我國新疆［20］、內蒙古［21］、黑龍江［22］、寧夏［23］、陜西［24］、四川［25］、天津［26］、河北［5］、安徽［27］、上海［28］等 14 個地區分離的牛源S.aureus對PG、AMP和SXT均表現出極強的耐藥性；大部分省區分離株對ERY耐藥；新疆、天津、江蘇地區的S.aureus分離株對TET耐藥，其他省區對其表現介于耐藥與敏感之間；新疆、天津、安徽、四川和江蘇分離株對CLI耐藥；河南和陜西分離株對AMO耐藥性較強；其中河北地區S.aureus耐藥菌株最多，對10種抗菌藥物表現不同程度耐藥，說明我國奶牛乳房炎分離的S.aureus菌株耐藥性種類較多，多耐性較廣泛。結合表1，世界范圍內奶牛乳房炎S.aureus耐藥及MDR普遍存在。我國與世界其他地區研究結果一樣，不同地區分離的S.aureus菌株對各類常見抗菌藥物表現不同程度的耐藥性，但地區與地區之間S.aureus耐藥菌株差異較大，進一步說明S.aureus耐藥性可能具有一定區域性。S.aureus對β-內酰胺類抗菌藥物耐藥性最嚴重，這也與國外研究結果一致，說明β-內酰胺類仍然是治療奶牛乳房炎使用最廣泛的一類抗菌藥物，導致S.aureus菌株在世界范圍內對其高度耐藥，符合世界性觀察到的S.aureus耐藥性普遍趨勢。

表1 2011-2018 年奶牛乳房炎S.aureus 對10 種常見抗菌藥物耐藥性［11-19］

事實上，S.aureus菌株的耐藥性越來越強，已經發展出廣譜的抗菌藥物抗性機制，這意味著隨著耐藥性的不斷發展，新的耐藥機制將會不斷地出現，且變得更為復雜，必定導致S.aureus對臨床所用抗菌藥物的耐藥程度日漸嚴重，加劇臨床治療難度。

2 奶牛乳房炎金S. aureus耐藥機制

S.aureus的耐藥性機理復雜，總結主要有以下幾種：（1）酶失活；（2）主動外排系統；（3）保護、改變、更換抗菌藥物靶位點；（4）基于質?；蛉旧w上的耐藥基因介導的S.aureus耐藥機制。現階段，由基因編碼介導的S.aureus分子耐藥機制成為各國相關學者研究熱點。

2.1 S.aureus對β-內酰胺類抗菌藥物的耐藥機制

S.aureus對β-內酰胺類抗菌藥物的耐藥機制主要有以下兩種：（1）質粒介導的獲得性耐藥。S.aureus菌株由耐藥因子生成了β-內酰胺酶，此酶附著在細菌表面，經質粒介導，通過胞外β-內酰胺類藥物的水解，致使產酶株與非產酶株相比抗菌藥物的活性降低或消失，導致S.aureus對β-內酰胺類藥物產生耐藥；（2）藥物結合位點的改變或形成新的青霉素結合蛋白（Penicillin binding protein，PBP）介導的固有耐藥。PBPs是構成S.aureus細胞壁形成的重要蛋白酶系統，也是β-內酰胺類抗菌藥物與S.aureus菌體的結合靶位點，與其具有較高親和力。當環境藥物濃度達到最小抑菌濃度（Minimum inhibitory concentration，MIC）時，β-內酰胺類藥物與PBPs結合，使其乙?；?，導致轉肽酶（Transpeptidase，TPase）失活，便會讓細菌難以形成細胞壁，從而導致敏感菌死亡［29］。

PBPs的改變是S.aureus對β-內酰胺類藥物耐藥的重要機制［30］。PBPs在MRSA對苯唑西林的耐藥程度中發揮至關重要的作用。β-內酰胺酶、PBPs的過量表達可導致MRSA的低水平耐藥，PBPs與苯唑西林的親和力也是MRSA低水平耐藥的原因之一；而PBP2a的存在則導致MRSA高水平耐藥，與其他PBPs不同，PBP2a與β-內酰胺類藥物親和力極低甚至不與其結合，致使MRSA高水平耐藥。而mecA是PBP2a的編碼基因，MRSA的分子耐藥機制與mecA基因密切相關?？偨Y有以下兩種。

mecA是MRSA的耐藥決定子，MRSA的mecA基因通過轉座子的移動得到外來基因，該基因大量表達使S.aureus對甲氧西林耐藥的產物PBP2a合成。另有資料表明，作為MRSA耐藥輔助基因的fem型基因在細菌細胞壁生成環節至關重要，其中femA、femB這兩種基因在S.aureus對β-內酰胺類藥物耐藥方面具有重大影響［31］。據報道，β-內酰胺類抗菌藥物針對MRSA的抗藥性或可由femA、femB的失活導致，以此同時也造成了其他多種類抗菌藥對MRSA的敏感性大幅提升［32］。2014年，萬艷紅［33］在51株MRSA菌株中發現mecA、femA基因檢出率均為100%；另有研究對河南地區180株MRSA菌株進行PCR檢測，發現有168株mecA基因陽性（符合率為93.3%），且多為MDR菌株［34］。MSRA產生的高耐藥性，實質上是由fem基因協同mecA基因產生的表型，但當mecA與fem其中一方失活后，這一效果便大打折扣。在fem基因失活的前提下，盡管PBP2a可由mecA單獨編碼產生，但偶見細菌仍出現高度耐藥現象［35］。由于mecA和femA基因在MRSA對苯唑西林等β-內酰胺類抗菌藥物耐藥的重要地位，且其主要存在于耐藥菌中，因此，國際上通常檢測mecA和femA兩個基因以判定S.aureus對甲氧西林抗菌藥物是否耐藥。

S.aureus的耐藥性可能與其細胞壁的形成相關，而PBP2a可能會加速該現象出現，即使相關PBPs活性在β-內酰胺類藥物干預結合下而降低，這一現象仍會發生。實驗表明，PBP2a不會單方面促成β-內酰胺類抗菌藥物對MRSA的耐藥性，若沉默PBP2基因，可降低對甲氧西林的耐藥程度［36］；另外，阻斷PBP2的TGase活性時，抗菌藥物的存在致使PBP2抑制TPase活性，PBP2a則可恢復TPase活性，實現細菌肽聚糖合成與細胞壁骨架搭建［37］。由此可知，MRSA的耐藥性是其細胞壁上合成了相關肽聚糖，而PBP2a則協同PBP催化了該過程。

2.2 S.aureus對四環素類抗菌藥物的耐藥機制

在對S.aureus測序后發現，其基因序列中包含了滅活酶基因、排外基因、核糖體保護基因及未明機制的基因等。共40多種耐藥性基因，而這些耐藥性基因均指向四環素類藥物，這就揭示了S.aureus對四環素類抗菌藥物耐藥的本質［38］。在系列針對耐四環素類藥物的研究中發現，多數研究主要著力在主動排外基因和核糖體保護基因等基因，TetK、TetO、TetL、TetA及TetC等基因均包含于此。其中在奶牛源葡萄球菌中介導四環素耐藥的基因主要為TetL和TetK，TetM和最為罕見的TetO也在牛源葡萄球菌中被檢出。國外有學者利用PCR技術檢測對S.aureus中可能存在的耐四環素抗菌藥物基因片段發現：在分離的90株S.aureus中，TetK基因的檢出率為84%，TetL基因為9%，TetM為2%，TetO僅為1%［39］。這些耐藥基因能夠產生介導四環素耐藥的保護蛋白，以質粒或轉座子為媒介在各個菌體間快速地產生、擴散著對此類抗菌藥物的耐藥性。

2.3 S.aureus對氨基糖苷類抗菌藥物的耐藥機制

S.aureus對氨基糖苷類抗菌藥物的耐藥機制主要有以下3種：（1）藥物結合位點的改變。發生基因突變現象，致使藥物無法發揮抑菌或殺菌作用而形成耐藥；（2）膜屏障的改變或主動外排作用。減少此類抗菌藥物的吸收或阻止藥物進入細菌內而產生耐藥；（3）氨基糖苷修飾酶（Aminoglycosides modifying enzyme，AMEs）的修飾鈍化作用。AMEs通過修飾此類抗菌藥物的特定基團，使其降低或失去對靶位核糖體的親和力而喪失生物活性，從而產生耐藥性。這是S.aureus對該類藥物產生耐藥的主要機制。研究發現，氨基糖苷類抗菌藥物耐藥的基因中，氨基糖苷乙酰轉移酶（Aminoglycoside acetyltransferases，AAC）6′和氨基糖苷磷酸轉移酶（Aminoglycosidephosphotransferases，APH）2′′基 因分別編碼雙功能酶AAC6′和APH2″，這兩種編碼基因可使S.aureus對GM、K、丁胺卡那（Amikacin，AMK）、妥布霉素（Tobramycin，TM）和奈替米星（Netilmicin，NET）等產生耐藥性［40-41］；Turutoglu 等［42］從奶牛乳房炎分離出了18株MRSA菌株，進行PCR耐藥基因檢測及序列分析發現，有3株mecA陽性基因編碼耐甲氧西林，并證明了這3株菌株存在AAC6′、APH2″、APH3′等基因編碼的氨基糖苷類耐藥，表明攜帶氨基糖苷類修飾酶基因的3株菌株對慶大霉素、卡那霉素和新霉素耐藥；徐佳［43］對奶牛乳房炎葡萄球菌種類及耐藥性研究表明，32.1%的S.aureus為AACA、APHD基因檢測陽性，證實了表達AAC6′、APH2″是S.aureus對氨基糖苷類抗菌藥物耐藥的主要原因；Crossman等［44］學者在對S.aureus全基因組的研究中發現，S.aureus帶有多種擬多重耐藥轉運蛋白基因。目前，國內外相關報道罕見，其功能和具體作用機制尚未明確，尚需進一步研究。

2.4 S.aureus對大環內酯、林可胺類（Macrolides lincosamides，MLs）抗菌藥物的耐藥機制

S.aureus對MLs抗菌藥物的耐藥機制主要有3種：（1）藥物活性被鈍化；（2）藥物與菌體的作用位點突變；（3）菌體內形成了主動轉運藥物系統。

多項研究表明，紅霉素核糖體甲基化酶（Erythromycin ribosome methylase，erm）基因、msr基因是介導MLs抗菌藥物耐藥的兩個主要基因。S.aureus染色體或質粒上攜帶erm、msr基因，分別編碼核糖體甲基化酶和轉運蛋白［45］，這兩種編碼基因通過修改抗菌藥物與菌體的結合位點，抑制MLs類抗菌藥物，從而使得S.aureus對MLs抗菌藥物耐藥［46］。其中erm基因是介導S.aureus對MLs抗菌藥物產生廣泛耐藥的主要原因，erm基因表達及其上游啟動子出現突變均可致使MLs產生耐藥，當核糖體蛋白L4和大亞基的23S rRNA堿基突變而抑制該類藥物與核糖體靶位點結合，也可導致MLs抗菌藥物耐藥［47］；而msrA和msrC基因編碼的主動泵出系統可將MLs抗菌藥物從細胞中排出，以保持細胞內低濃度MLs藥物水平。報道稱，msrC基因在介導S.aureus對紅霉素高水平耐藥中發揮重要作用［48］。

erm、msr基因已被證實在牛源S.aureus中檢出。Kot等［49］研究表明，奶牛乳房炎中S.aureus檢出率16.4%，其中15.6%對MLs抗菌藥物產生了耐藥性，對其抗性基因檢測得出，ermA、ermB和ermC的檢出率分別是14.8%、11.1%和55.5%；2018年，最新研究表明，牛源奶酪被認為是抗菌藥物耐藥基因的儲存庫，S.aureus分離率為4.3%，16S rRNA基因的DNA序列鑒定結果顯示，耐藥基因msrA攜帶率為60.9%，msrB攜帶率為46.6%［50］。說明S.aureus及MLs耐藥基因分離率因地域性不同差異較大。

2.5 S.aureus對喹諾酮抗菌藥物的耐藥機制

S.aureus對喹諾酮類抗菌藥物（Quinolone antibiotics）耐藥的機制主要有3種：（1）藥物靶酶及編碼基因的突變。DNA促旋酶和拓撲異構酶IV是喹諾酮類藥物對S.aureus發揮抗菌作用的靶酶，grlA和grlB基因編碼DNA促旋酶，grlA、grlB和parC基因編碼拓撲異構酶IV［51］。李曉娜等［52］報道220株奶牛乳房炎S.aureus菌株中grlA基因、gyrA基因和norA基因的檢出率分別為80%、78.64%和78.18%，說明奶牛乳房炎S.aureus攜帶喹諾酮類藥物耐藥基因，這些基因位點的突變可引起喹諾酮類藥物作用的靶位改變，從而導致S.aureus對喹諾酮類藥物耐藥。但不同結構的喹諾酮類藥物對S.aureus的作用位點不同。苗貝貝等［53］通過研究左氧氟沙星、莫西沙星和奈諾沙星3種喹諾酮類藥物對S.aureus耐藥突變體的體外抗菌活性發現，左氧氟沙星優先作用于S.aureus拓撲異構酶Ⅳ靶位parC基因，而莫西沙星和奈諾沙星則幾乎同時作用于S.aureusDNA促旋酶靶位grlA基因和拓撲異構酶Ⅳ靶位parC基因。該類藥物耐藥性與這些靶位酶基因密不可分，統稱為喹諾酮類藥物耐藥決定區（Quinolone resistance-determining regions，QRDR）基因 ；（2）主動外排系統。主要為norA、norB、norC基因介導的主動外排系統［56］，使藥物在菌體內蓄積量減少，從而介導喹諾酮類藥物低水平耐藥；（3）質粒介導的耐藥機制。質粒介導的喹諾酮類藥物耐藥（Plamidmediated quinolone resisitence，PMQR） 機 制 通 過PMQR基因實現。目前，qnr、Aac6’-Ib-cr、qepA和oqxA/B基因的作用機制已較為成熟，主要通過以下5種方式介導S.aureus產生耐藥：①與喹諾酮作用靶酶結合，降低藥物對細菌的抑制作用；②提高細菌MIC，增加細菌耐藥率；③促進細菌染色體基因自身突變，增加高水平耐藥菌株；④將藥物排出菌體外，降低藥物在菌體內的蓄積量；⑤使gyrA、parC功能區發生突變，細菌趨于高水平耐藥。而Cfr和fexA兩種基因在牛源S.aureu中報道較少，是今后挖掘S.aureus對喹諾酮類分子耐藥機制的新元素。

表2 S.aureus常見的基因突變位點［51-55］

3 結語

奶牛乳房炎S.aureus面臨著嚴峻的耐藥及其耐藥基因流行傳播形勢，出現了多重耐藥現象，但細菌耐藥性的產生是一種天然抗生現象，現代畜牧業中抗菌藥物的使用不可避免，隨著細菌耐藥性的快速發展，S.aureus耐藥機制日漸復雜。因此，應重點關注S.aureus耐藥現狀及其變遷情況，從分子水平深層探索S.aureus耐藥機制，發現新的耐藥基因，找出削減S.aureus及MRSA耐藥機理，避免抗菌藥物的惡循環濫用，為奶牛乳房炎設計合理的臨床治療方案。奶牛乳房炎源病菌耐藥性監測試劑盒和相應新型抗菌藥物的研發是相關研究領域發展趨勢。