環化熒光蛋白生物探針熒光壽命成像研究進展

周加勝 王鵬 周黃梅 許金銘 張三軍

（1. 華東師范大學精密光譜科學與技術國家重點實驗室，上海 200062；2. 華東師范大學物理與材料科學學院，上海 200241）

如今，熒光蛋白已經被廣泛用于生命科學的研究中，而作為生物探針是它的一項重要應用。通過基因編碼的熒光蛋白探針可以實現對生物小分子的特異性檢測，以及實時監測生命過程，從而為病理研究、疾病早期發現提供一種強有力的工具。相比于化學染料探針，基因編碼的熒光蛋白探針生物兼容性更好，細胞毒性更小，同時在細胞內的定位也更加準確，一般不會損壞細胞，可以更好的減少人為因素的干擾。環化熒光蛋白探針是近些年來發展比較迅速的一類生物探針，獨特的構造方式使其更容易感受外界環境的變化，從而在生物檢測方面表現出優異的性能，引起了越來越多科學家的注意，現已發展成為一類重要的熒光蛋白探針。但受制于生物活體內的復雜性及目前檢測方法的局限性，還有環化熒光蛋白自身的原因，如亮度低、易受pH值影響、會被光漂白等原因，導致能夠真正用于科學研究的環化熒光蛋白探針并不多。本文主要從環化熒光蛋白發展，現階段的檢測方法，以及目前所存在的問題這些方面進行綜述，旨在為環化熒光蛋白探針的進一步發展及應用提供參考和幫助。

1 環化熒光蛋白探針發展狀況

1.1 環化熒光蛋白的設計理念

對于綠色熒光蛋白而言，其由11條螺旋組成的桶和1條穿過桶中心的螺旋構成，發色團則為處于桶內部65-67位的3個氨基酸殘基［1-2］。通常，由于單獨的發色團會與周圍的溶劑相互作用，以及自身的振動和轉動，導致非輻射躍遷過程太強，所以是不發光的。而當處于桶內，由于限制了振動與轉動，減少了發色團的非輻射躍遷而增強了輻射躍遷過程，從而產生熒光。對于其他顏色的熒光蛋白，其組成結構與綠色熒光蛋白基本類似。而熒光蛋白生物探針對物質檢測的原理是探測物與熒光蛋白相互作用影響了發色團的光物理性質，從而根據光強或者其他信息的變化來實現對檢測物濃度或者其他信息的標定。

對于環化熒光蛋白探針而言，目前設計的基本原理是在原始熒光蛋白的合適位點打開肽鏈，并在產生的初始N端和C端之間接上合適的肽鏈，就可以在發色團的附近產生新的N端和C端。然后在新的N端和C端接上合適的、對某種探測物特異性響應的結合域蛋白［4-5］，并通過多次篩選，從而得到所需的環化熒光蛋白探針（圖1）。當結合域蛋白和探測物結合后會改變結合域蛋白的構象結構，從而影響熒光蛋白發色團所處的微環境，進而改變其發光特性，利用其光物理性質的變化對探測物的濃度等信息進行監測。例如，基于環化熒光蛋白的HyPer系列氧化還原類探針，依賴的原理就是H2O2進入結合域蛋白的疏水腔從而改變疏水結構，在殘基間形成二硫鍵使得結合域蛋白的構象急劇變化，影響了熒光蛋白發色團所處的微環境，導致光物理性質發生改變（圖2），而后根據光譜的變化實現測量［6-9］。因為二硫鍵在一定條件下對氧化還原狀態比較敏感，所以Fan等［10］在2015年的報道中提出直接將二硫鍵插入到環化熒光蛋白的N端和C端之間，以此來檢測氧化還原狀態的改變。可見，環化熒光蛋白探針并不一定需要具備結合域蛋白，重要的是在新產生N端和C端之間提供一個可以感受探測物的位點，這表明環化熒光蛋白的結合區域也可以由化學小分子或者其他物質來充當。

圖1 環化熒光蛋白構建模型示意圖［3］

1.2 環化熒光蛋白生物探針的發展

自 從 1997年，Miyawaki和 Tsien 等［11］在Nature雜志上報道首個基于綠色熒光蛋白的Ca2+探針后，該課題組便不斷嘗試使用其他方法構建新的Ca2+探針。1999年，Tsien和Baird等［4］使用環化青色熒光蛋白取代供體的原始青色熒光蛋白，試圖提高探針的動態響應范圍。盡管最后在加入飽和的Ca2+后強度比率變化僅為15%，但作者認為這個結果并不能否定環化熒光蛋白在生物探針方向的潛力，也為環化熒光蛋白的設計打開了大門。在此啟發下，Miyawaki課題組［12］在2001年報道了基于環化熒光蛋白開發的第一種實用Ca2+探針，即Pericam。Pericam融合了攜鈣素（CaM）和目標肽M13作為Ca2+響應區域，在結合Ca2+之后，利用激發光譜中的峰值強度比例變化情況來檢測Ca2+濃度。在他們的工作中得到的一系類變體均具有較大的動態響應范圍，并成功地實現了細胞內的Ca2+的檢測。之后，一系列的Ca2+環化熒光蛋白探針被開發出來，并被用于多個方面［13-17］。表1列出了這些年來出現的大部分的基于環化熒光蛋白設計的生物探針。

圖2 HyPerRed檢測原理示意圖（根據文獻重新繪制［9］）

可以看出，近些年來基于環化熒光蛋白設計的生物探針越來越多。主要的使用范圍還是用于對細胞內代謝產物的研究、細胞內氧化還原狀態的監測以及藥物篩選等領域，對體外物質的檢測比較少。而且，值得注意的是，對某一類物質特異性響應的環化熒光蛋白探針的發展也是一個不斷改進的過程。例如，第一代Hyper由環化黃色熒光蛋白和來自大腸桿菌中對H2O2敏感的結合域蛋白OxyR-RD組成，顯示出對H2O2亞微摩爾的親和力，但是動態范圍只有3倍左右［6］。為解決第一代Hyper動態范圍小的問題，Hyper-2被研發出來，其動態范圍達到6倍［7］。但是Hyper-2是強二聚體，導致其對氧化還原動力學響應較慢，無法實現實時監測。在此基礎之上，又開發了第三代Hyper-3［8］，它對H2O2具有更快的響應速率，而且動態變化范圍和Hyper-2類似。從上面表1中可以看出來，目前環化熒光蛋白探針的動態響應范圍還不是很大，普遍在10倍以內，有的甚至變換不到2倍，如2016年在Science上報道的對NAD+檢測的環化熒光蛋白探針［33］。總的來說，動態范圍大、響應快速的環化熒光蛋白探針是一個重要的發展方向。

2 環化熒光蛋白生物探針的檢測方法

目前環化熒光蛋白探針對物質檢測時所使用的方法主要還是基于熒光強度和熒光比率這兩種。對于使用熒光強度方法的環化熒光蛋白探針，其穩態熒光光譜一般只有單一的激發峰和發射峰。如對過氧硝酸鹽檢測的pnGFP［43］，通過探測加入探測物之后單個熒光通道的熒光強度變化，從而實現對物質的定量測量。而使用熒光比率方法的環化熒光蛋白探針，其穩態熒光光譜一般具有兩個激發峰，或者兩個發射峰，可進一步分為激發比率型探針和發射比率型探針。如YCs系列環化熒光蛋白探針就是基于發射比率的方法對Ca2+進行檢測，FlincGs探針則是基于激發比率來檢測cGMP［19，35］。無論激發比率型還是發射比率型環化熒光蛋白探針，都是通過測量兩個波長處的熒光強度比值變化情況來實現對探測物的定量檢測。由于兩個波長處的熒光強度來自同一蛋白，所以二者的比值跟環化熒光蛋白生物探針的濃度無關。最理想的情況是兩個波長處熒光強度變化情況相反，從而熒光比值能夠更靈敏的檢測探測物的變化。總而言之，熒光比率的方法可以不受環化熒光蛋白在細胞內表達的影響，具備了可以直接檢測探測物絕對濃度的能力，同時又具有大的靈敏度。

從上面介紹中我們可以得知，能使用熒光比率方法的探針一般來說都可以使用熒光強度的方法，但是對于只具有單一激發峰和發射峰的環化熒光蛋白探針一般只能使用熒光強度的方法。如果針對某一物質為了實現比率型方法測量而重新設計一種全新的探針，勢必需要大量的工作。科學家們為了解決這個問題，通過在原有環化熒光蛋白探針上接上另一種不同顏色的熒光蛋白來實現比率測量的目的。由于兩種發光蛋白都是已知的，這樣一來也就減少了工作量。例如，Peredox是一種檢測還原型輔酶和其氧化物濃度比值的探針（NADH/NAD+），它只有單一的激發峰和發射峰［30］。Hung和Yellen等［30］通過在Peredox上連接紅色的熒光蛋白mCherry，來形成一種新的探針Peredox-mCherry。在使用過程中利用mCherry的熒光強度來標定環化熒光蛋白探針在細胞內表達的量，從而消除熒光強度型探針易受細胞內表達量影響的缺點，對NADH/NAD+比率的測量則還是利用新探針的內部的Peredox。即使用mCherry熒光強度對Peredox的熒光強度幅值進行修正，從而實現了比率測量的目的。但是作為一個有多個發色團的環化熒光蛋白，Peredox-mCherry的分子量很大，容易引起蛋白聚集等效應，影響探針的使用。而且，該探針中的綠色熒光蛋白和紅色熒光蛋白的成熟和光漂白過程不同步，限制了該探針的性能。不過由于減少了工作量，這樣的方法也為環化熒光蛋白的設計提供了新的思路。

表1 環化熒光蛋白生物探針及特性

3 時間分辨熒光在環化熒光蛋白探針中的應用

3.1 時間分辨熒光方法的優勢

雖然相對于電化學等方法，熒光強度和熒光比率的檢測方式可以避免對細胞產生損害。但是這兩種方法都屬于穩態熒光方法的范疇，本質上還是基于熒光強度的測量來實現檢測目的。這就帶來了一個問題，因為測量熒光強度的儀器設備在不同廠商制造時所使用的標準并不一樣，無論是穩態熒光光譜儀、酶標儀，還是共聚焦顯微成像系統都有這個問題，所以在用不同的設備對細胞內的物質進行定量測量時所得到的結果嚴格來說并不能直接進行比較。時間分辨熒光的方法為此提供一個解決途徑，它通過測量熒光壽命的變化來標定分析物的濃度。一般來說，環化熒光蛋白的熒光壽命會隨著探測物的加入而發生改變，通過測量熒光壽命的變化，從而可以得出探測物濃度等信息。相對于穩態熒光方法，時間分辨熒光方法由于提供了一個通用的標準——“時間”，這就允許了在不同設備上測得的數據可以直接比較。同時熒光壽命反映的是環化熒光蛋白生物探針從激發態返回基態的過程，在合理的濃度下，與熒光蛋白的數量無關。所以環化熒光蛋白在細胞內表達的數量并不影響其熒光壽命，具備了比率型方法不受發色團濃度影響的優勢。同時有些熒光物質由于光譜相似，使用穩態的方法難以區分。如還原型輔酶NADH和NADPH，由于它們的光譜非常相似，如何利用光學的方法將它們區分曾一度困擾著科學家［52］。除了發展對它們各自特異性響應的熒光探針外，2014年，Blacker等［53］使用時間分辨熒光技術，結合數學模型很好的解決了這個問題。這顯示出時間分辨熒光方法在物質檢測領域具有獨特的優勢，未來在環化熒光蛋白探針中也必將發揮更大的作用。

表2 環化熒光蛋白探針種類的熒光壽命及測量環境

3.2 熒光壽命成像在環化熒光蛋白探針中的應用

相比于熒光顯微鏡，基于熒光強度對生物組織進行成像，也可以在此基礎上，基于時間分辨熒光的方法，利用熒光壽命大小對生物組織成像。通過不斷的激發和掃描樣品，再經過分析得到每個像素點處的熒光壽命大小，進而觀察生物組織不同位置的熒光壽命變化情況，以此來監測探測物。即將體外一維的壽命信息，通過成像技術轉變為二維的圖像。通過我們的文獻調研，表2列出了目前已知的環化熒光蛋白探針在熒光壽命方面研究的結果。

從表2中可以看出目前熒光壽命成像（Fluorescence lifetime imaging microscopy，FLIM）技術在環化熒光蛋白探針上的應用剛剛起步，近些年才開始逐漸使用。而且大多數被用于還原型輔酶NAD（H）方面［31，33，54-57］，應用的還不是十分廣泛，但已表明時間分辨熒光方法的優勢。除了儀器比較昂貴以外，限制FLIM技術應用的主要原因，在于環化熒光蛋白探針的平均熒光壽命在探測物濃度改變的時候變化并不明顯，通常只有不到1 ns的熒光壽命變化。甚至有的環化熒光蛋白探針熒光壽命幾乎不變化，如2016年報道的對NAD+檢測的環化熒光蛋白［33］。如此小的平均熒光壽命變化限制了探針對探測物響應的動態范圍，自然限制了這種方法在該類探針上的使用。如果要解決這個問題，一方面是要通過不斷的突變和篩選，得到熒光壽命變化更明顯的環化熒光蛋白探針；另一方面要不斷的研究環化熒光蛋白的發光機理，探究影響環化熒光蛋白熒光壽命變化的因素，從根本上解決目前環化熒光蛋白平均熒光壽命變化小的問題，為以后的環化熒光蛋白的設計提供指導。

圖3 部分強度比值方法原理示意圖［56］

在現有的條件下，也可以通過探索新的方法達到增大變化動態范圍的目的。我們知道一般環化熒光蛋白探針的熒光衰減并不是按照單一指數衰減，而是有多個衰減成分。平均熒光壽命只是各組分壽命綜合作用的表現，并不代表每一組份壽命的變化情況，這也表明可以進一步挖掘熒光壽命的信息進行物質檢測。2017年，Chang等［56］利用部分熒光強度比值的方法實現了對探測物濃度的表征，極大的擴大了動態范圍。其原理如圖3所示，通過對Peredox環化熒光蛋白探針在加入NADH前后的時間分辨熒光衰減曲線進行擬合（圖3-A，3-B），拆分出τ1、τ2和τ3這3個熒光壽命組成成分以及它們各自所占的比重α1、α2和α3。在圖3-C，3-D中分別用綠藍紅這3種顏色來表示τ1、τ2和τ3，其中不同的直線斜率代表了不同的壽命大小，而熒光衰減曲線下不同顏色所占的面積則表示了不同組分對整體熒光強度所占的貢獻，它的大小跟部分強度相關。可以看出，加入NADH后部分強度α1τ1增大，而α2τ2減小，利用它們比值 α1τ1/α2τ2的變化來實現對探測物濃度的定量測量（圖3-E）。這種方法可以極大的擴展動態范圍，即使像Frex這種平均熒光壽命變化動態范圍變化只有1.09倍左右的環化熒光蛋白探針，在此方法的處理下，也可以得到了4倍多的動態范圍［56］。而且對于Peredox這種只有單一激發峰和發射峰的環化熒光蛋白探針，利用此方法同時實現了比率測量，無需在其上面接上新的熒光蛋白，這是在穩態熒光方法中目前還實現不了的。隨著環化熒光蛋白探針的研究越來越深入，時間分辨熒光這種方法會發揮出越來越重要的作用。

4 現階段的問題

無論是使用哪種方法對物質進行檢測，前提條件還是環化熒光蛋白探針的性質要優良。值得注意的是，目前大多數的環化熒光蛋白熒光探針都會或多或少受pH值的影響。主要的原因是pH值會影響處于質子型和離子型狀態的環化熒光蛋白比例，從而干擾對探測物濃度的測量。現在消除pH影響可以通過努力篩選出一種對pH值不敏感的熒光蛋白探針，這需要極大的工作量，如Peredox經過大量的定點突變消除了探針的pH敏感性［30］。更普遍的方法是利用額外的熒光蛋白對pH的影響進行校準和修正，如 SoNar和 FHisJ［32，51］。而且目前大多數的環化熒光蛋白探針都是基于黃色或者綠色熒光蛋白設計的（表1），這些短波長的熒光在生物組織內部的散射性太大，導致成像深度不深，而且對細胞的光毒性也比較大。而環化紅色熒光蛋白探針由于突變的困難，目前還沒有被廣泛的開發出來。相比于化學染料探針，目前的環化熒光蛋白探針的動態范圍還比較小，這也是普遍存在的一個問題。同時，現階段的使用的探測方法還比較單一，時間分辨熒光的還沒有被普遍使用。同時值得注意的是，拋開環化熒光蛋白探針自身性質的因素，FLIM這種基于時間分辨熒光的技術也有其自身的缺點。因為FLIM得到的是一個二維圖像，其圖像上的每個像素點都代表著一條時間分辨熒光衰減曲線。在我們的實驗中，每一幅圖有6萬多個像素點，這也就是6萬多條時間分辨熒光衰減曲線。而且，每條曲線如果要得到準確的擬合，就要保證在每個像素點有足夠多的光子數被記錄。同時為了保證單光子探測的效果，光子計數率不能太大。這些原因會導致為了得到一副準確的熒光壽命圖像需要測量大量的時間。一般發光強度比較弱的環化熒光蛋白并不適合使用FLIM技術，因為會導致細胞長時間處于在光照下，從而產生光漂白以及損害細胞活性等問題。同時，開發出一個新的熒光探針的工作量仍然很大，科學家們在過去十幾年間也對設計環化熒光蛋白的方法進行不斷的研究［21，58-59］。例如，2017 年，Wongso 等［59］報道了一種基于環化熒光蛋白設計生物探針的新方法，并把這類探針稱為Flashbody。這類探針采用抗體作為結合域蛋白，通過優化熒光蛋白與抗體的連接方式產生最佳的效果。相比于從天然蛋白質中篩選結合域蛋白這種費時費力的方法，使用抗體充當結合域蛋白則會使探針的開發簡單得多，在某些方面會極大的減少工作量，也會減少開發的盲目性。Ast等［21］也報道了一種基于環化熒光蛋白設計生物探針的通用開發平臺。它采用俄羅斯套娃的模式，將兩個熒光蛋白進行嵌套，然后將其插入在結合域蛋白的合適位置。其中一個熒光蛋白用來修正非探測物因素對熒光探針的影響，另一個蛋白則用來對探測物進行響應，利用二者的熒光強度比值來實現對探測物的準確測量。可以看出，目前的環化熒光蛋白的一大研究方向就是盡量減少開發的工作量，使開發流程能夠簡單化，同時又要保證熒光探針能實現對探測物的準確測量。

5 結語

本文回顧了這些年來環化熒光蛋白探針的發展狀況，比較了幾種探測方法的優劣，以及環化熒光蛋白目前存在的問題。總體上說，環化熒光蛋白探針正在越來越多的被科學家注意到，更多的環化熒光蛋白探針也被愈加廣泛的被應用在生命科學領域去解決不同的問題。雖然目前還存在著諸多問題，但是隨著對環化熒光蛋白研究的不斷深入，以及設計方法不斷的完善，動態范圍更大、特異性更好、響應速度更快、亮度更強、抗漂白性更好、pH值耐受性更強、發光波長更長的環化熒光蛋白生物探針也必定會被陸續被開發出來。在探測的方法上，也會隨著對這類蛋白機理研究的更加深入，不斷的發展新的探測和分析方法。同時隨著學科之間融合的更加密切，環化熒光蛋白也必將會在生命科學領域發揮越來越重要的作用。