三疣梭子蟹C型溶菌酶在畢赤酵母中的表達及其抑菌活性

王強厚 陶妍 崔旭 顏倩倩 張亞莉

（上海海洋大學食品學院 上海水產品加工及貯藏工程技術研究中心，上海 201306）

溶菌酶廣泛存在于動物、植物和微生物中，是一種能夠水解致病菌中黏性多糖的堿性酶，被認為是體內免疫保護系統的必要組成成分；也是甲殼動物非特異性免疫系統的重要組分，在其免疫防御中發揮重要作用［1-2］。溶菌酶通過破壞細胞壁中的N-乙酰胞壁酸與N-乙酰氨基葡萄糖之間的β-1，4糖苷鍵而使細胞壁破裂，進而致死細菌。溶菌酶主要分為6種類型：C型（Chicken-type）溶菌酶、G型（Goose-type）溶菌酶、無脊椎動物型溶菌酶、植物溶菌酶、真菌和細菌溶菌酶、T4噬菌體溶菌酶［3］。其中C型溶菌酶已經在昆蟲、爬行動物、鳥類和哺乳動物中被發現［4-5］，此外，在甲殼動物中也發現有 C 型溶菌酶［6-7］。

目前，就水產生物而言，在三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）［8］、 中 國 明 對蝦（Fenneropenaeus chinensis）［9］和 凡 納 濱 對 蝦（Litopenaeus vannamei）［10］等無脊椎動物中已發現存在C型溶菌酶基因；同時，在斑點叉尾鮰（Ictalurus punctatus）［11］、 虹 鱒（Oncorhynchus mykiss）［12］、點帶石斑魚（Epinephelus coioides）和赤點石斑魚（Epinephelus akaara）［13-14］等硬骨魚中也發現了C型溶菌酶基因。迄今為止，關于水產生物來源的C型溶菌酶在原核細胞中表達的研究報道較多，例如，日本對蝦（Penaeus japonicus）［15］、仿刺參（Apostichopus japonicus）［16］、赤點石斑魚［14］和斑點叉尾鮰［17］的C 型溶菌酶已經在大腸桿菌中得到表達；張輝等［8］報道了三疣梭子蟹C型溶菌酶在大腸桿菌中的表達，且表達產物對溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）、哈維氏弧菌（Vibrio harveyi）和鰻弧菌（Vibrio anguillarum）均有一定的抑菌作用。

然而，原核表達系統存在眾所周知的缺點，如對表達產物不能進行翻譯后加工修飾，以致表達的目的蛋白會形成不溶性的包涵體，需要經過復雜的復性才能恢復構象和活性。與原核表達系統相比，巴斯德畢赤酵母（Pichia pastoris）作為真核表達的宿主，其有助于表達產物空間構象的形成，進而獲得具有生物學活性的重組蛋白，并可實現目的蛋白的細胞外分泌表達以方便表達產物的后續處理，是目前公認的外源蛋白表達的良好宿主［18］。

近幾年來，我們先后開展了對于尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus）［19］、大西洋庸鰈（Hippoglossus hippoglossusL.）［20］、斑點叉尾鮰［21-24］和斑馬魚（Danio rerio）［25］等數種魚類中不同抗菌肽的重組DNA表達研究；另一方面，以甲殼動物三疣梭子蟹為研究對象，對其PtCrustin 2和PtCrustin 3抗菌肽實現了在畢赤酵母中的重組DNA表達［26-27］。在上述研究的基礎上，最近我們聚焦于魚類來源溶菌酶的真核表達研究，已經對鯉魚（Cyprinus carpio）g型溶菌酶基因進行了cDNA克隆，并通過畢赤酵母表達系統獲得了重組g型溶菌酶［28］。此外，來自斑點叉尾鮰的C型溶菌酶基因也被克隆，并實現了其在畢赤酵母中的表達，重組C型溶菌酶顯示了對于枯草牙孢桿菌（Bacillus subtilis）的抑菌活性［29］。

三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）廣泛分布于日本沿海、韓國和中國等國家，是一種重要的商業蟹。目前，隨著養殖規模的不斷擴大以及養殖集約化程度的不斷提高，由細菌、真菌和病毒等引起的各種病害給三疣梭子蟹的養殖帶來巨大的損失，由此造成抗生素的濫用也埋下了食品安全的隱患。因此，尋求一種替代或部分替代抗生素的天然免疫因子成為從源頭解決這一問題的關鍵。據此，本研究以三疣梭子蟹C型溶菌酶基因作為重組DNA表達的目標，以期通過畢赤酵母表達系統獲得具有良好抑菌活性的三疣梭子蟹重組C型溶菌酶，為開發用于三疣梭子蟹安全養殖的天然抑菌劑提供技術途徑。為了實現上述目標，首先通過RT-PCR從其鰓中分離編碼C型溶菌酶的cDNA片段，以pPICZαA為表達載體，構建重組表達載體；電轉至畢赤酵母X-33后，通過博來霉素篩選陽性轉化子；通過甲醇誘導表達重組蛋白，并采用固化金屬離子親和層析（IMAC）和MALDI-TOF/TOF分別對表達產物進行純化和鑒定，最終通過平板涂布法和瓊脂糖擴散法檢驗三疣梭子蟹重組C型溶菌酶的生物學活性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質粒和菌株 克隆載體pMD-19T simple購自TaKaRa公司（日本）；畢赤酵母X-33和表達載體pPICZαA購自Invitrogen公司（美國）；大腸桿菌DH5α購自天根生物科技有限公司（北京）；用于抑菌活性測定的銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、枯草芽胞桿菌、副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）和沙門氏菌（Salmonella lignieres）均為本實驗室保藏。

1.1.2 主要試劑 限制性內切酶（XhoI、XbaI、SacI）和T4 DNA連接酶、TaqDNA聚合酶均購自TaKaRa 公司；胰蛋白胨、酵母粉購自OXOID公司（英國）；YNB（無機氮原）購自 BIOSHARP公司（美國）；DNA分子量標準、DNA割膠回收試劑盒、質粒提取試劑盒、酵母DNA提取試劑盒等購自天根生物科技有限公司；蛋白質分子量標準購自中科瑞泰生物科技有限公司（北京）；Western Blot 分析試劑購自康為世紀生物科技有限公司（北京）。

1.1.3 儀器 實驗所用儀器及型號如下：恒溫培養箱（XMT-A7000）、恒溫搖床（ZHWY-200H），高速冷凍離心機（CT14RD）、恒溫孵育器（Eppendorf，Thermostat plus）、PCR 儀（BIO-RAD，PTC-200）、聚丙烯酰胺凝膠電泳儀（BIO-RAD，Power Pac Basic）、電轉儀（BIO-RAD，Gene Pulser Xcell）、蛋白質純化儀（BIO-RAD，Profinia Protein Purification System）、賽多利斯切向回流超濾器（VIVAFLOW200）、酶標儀（BioTek SLFPTAD）。引物合成和DNA測序由上海生物工程有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 目的基因的擴增 參考三疣梭子蟹C型溶菌酶的全長cDNA序列（GenBank登錄號：FJ589729），設計用于PCR的引物（表1）；以實驗室原有的三疣梭子蟹鰓的第一股cDNA為模板［26］，通過3次PCR（圖1），擴增含XhoI、XbaI酶切位點和6×His標簽的三疣梭子蟹C型溶菌酶成熟肽基因“ptlyC”。第一次PCR的反應體系和條件：10×TaqPlus Buffer 1 μL、dNTP（2.5 mmol/L）0.8 μL、F1 和 R1（10 mol/L）各0.2 μL、模板 0.3 μL、TaqDNA 聚合酶（2.5 U/μL）0.1μL、dd H2O 7.4 μL；94℃ 3 min、94℃ 40 s、57℃ 30 s、72℃1 min、72℃ 5 min，30個循環。第二次PCR：以第一次PCR產物為模板、F2和R2為引物，反應體系和條件同上，除了退火溫度改為54.5℃。第三次PCR：以第二次PCR 產物為模板、F3和R2為引物，反應體系和條件同第二次PCR。將第3次PCR產物“ptlyC”割膠純化后與質粒pMD-19T連接后，轉入大腸桿菌DH5α感受態細胞中，37℃培養過夜，通過菌落PCR挑取陽性克隆，由上海生工生物工程有限公司測序。

表1 引物序列

圖1 PCR擴增目的基因的策略圖

1.2.2 重組表達載體的構建及鑒定 使用XhoI和XbaI對重組克隆質?！皃MD-19T-ptlyC”進行雙酶切，獲得目的片段“ptlyC”；在T4DNA連接酶作用下，將其與被同樣酶處理過的表達載體pPICZαA連接（16℃，30 min），轉入大腸桿菌感受態細胞DH5α中，37℃培養過夜。通過雙酶切和DNA測序驗證重組表達載體pPICZαA-ptlyC是否構建成功。

1.2.3 pPICZαA-ptlyC的轉化及陽性轉化子的篩選 重組表達載體“pPICZαA-ptlyC”經SacI酶切后，與畢赤酵母X-33感受態細胞混合（1∶8，V/V），轉入預冷的0.2 cm電轉杯中，冰浴5 min，1.5 kV、25μF、200 Ω，電擊5 ms，立即加入預冷的1 mol/L山梨醇；30℃孵育2 h后，離心將菌體涂布于含100 μg/mL博來霉素的YPD平板（1%酵母提取物、2%胰蛋白胨、2%瓊脂粉和2%葡萄糖）上，29℃培養3 d；挑取部分菌落分別接種在含500 μg/mL博來霉素的YPD平板上，篩選高拷貝酵母轉化子。同時，將挑取的酵母細胞轉接至MM平板（YNB13.4 g/L、甲醇5 mL/L、生物素0.4 mg/L、瓊脂15 g/L）上以篩選甲醇利用快速型酵母轉化子。對篩選到的酵母轉化子提取基因組 DNA，采用通用引物5′AOX1和3′AOX1（表1）進行PCR鑒定。

1.2.4 目的蛋白的誘導表達 挑取一個陽性轉化子接種于5 mL YPD培養基中擴大培養24 h，取500μL轉接至50 mL BMGY培養基（酵母提取物0.5 g、胰蛋白胨1 g、34% YNB 5 mL、10%甘油5 mL、0.02%生物素100 μL、1 mol/L磷酸鉀緩沖液5 mL）培養至OD600為2-6，離心收集菌體，重懸于50 mL BMMY培養基（酵母提取物0.5 g、胰蛋白胨1 g、34%YNB 5 mL、1% 甲 醇 500 μL、0.02% 生 物 素 100 μL、1 mol/L 磷酸鉀緩沖液5 mL）中，每隔24 h補加甲醇至終濃度1%。培養條件：pH6.0、28℃、250 r/min、72 h。每隔12 h收集培養液用于Tricine-SDS-PAGE分析（5%濃縮膠、12%分離膠、0.1 mol/L Tricine）。

1.2.5 表達產物的純化及Western blot分析 挑取1個良好的酵母轉化子，對其進行1 000 mL的擴大培養，表達條件同上，培養液經離心（11 000 r/min，15 min）后，收集上清過0.22 μm濾膜，通過切向回流超濾器對其進行超濾濃縮；濃縮液上蛋白質純化儀，根據儀器使用說明書進行蛋白質純化，采用BCA法測定蛋白質濃度。純化產物經Tricine-SDSPAGE 分析后，將凝膠電轉至PVDF膜上（100 V，恒壓1 h）；用TBST漂洗后加入封閉液封閉1 h；再用TBST漂洗后加入抗His標簽鼠單克隆抗體，室溫孵育2 h；再用TBST漂洗后加入辣根過氧化酶標記山羊抗小鼠IgG，室溫孵育1 h；最后用HRP-DAB顯色試劑盒顯色。

1.2.6 目的蛋白的抑菌活性測定 將處于對數生長期的銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、副溶血性弧菌和沙門氏菌分別與營養瓊脂混合（1∶1 000，V/V）倒平板，凝固后打直徑為6 mm的孔，加入100 μL純化的重組ptlyC，37℃培養12 h，觀察有無抑菌圈；同時，以100 μL洗脫緩沖液作為陰性對照。另一方面，取100 μL含重組ptlyC的培養液上清與1 μL對數生長期的枯草芽孢桿菌混合，37℃振蕩培養2 h后，取30 μL涂布于YPD平板上，37℃培養12 h，觀察抑菌效果。同時，以100 μL含空質粒的酵母轉化子的培養液上清作為陰性對照。

2 結果

2.1 基于PCR擴增的ptlyC基因及其cDNA序列

第一次PCR以三疣梭子蟹鰓的第一股cDNA為模板、F1和R1為引物，獲得645 bp的編碼三疣梭子蟹C型溶菌酶的全長cDNA（圖2泳道1）。第2次PCR以該全長cDNA為模板、F2和R2為引物，獲得652 bp的5′端含6×His標簽、3′端含終止密碼子TAG和XbaI位點的片段（圖2泳道2）。第3次PCR以該片段為模板、F3和R2為引物，擴增到657 bp 的5′端含XhoI位點和Kex2信號肽酶切位點、3′端含終止密碼子TAG和XbaI位點的編碼三疣梭子蟹C型溶菌酶成熟肽的目的片段“ptlyC”（圖2泳道 3）。

對目的片段的測序結果（圖3-A）顯示，除在5′和3’ 端添加的相關位點和標簽外，ptlyC編碼了由205個氨基酸殘基組成的三疣梭子蟹C型溶菌酶成熟肽；8個保守的半胱氨酸殘基和活性位點的2個殘基（谷氨酸和天冬氨酸）位于成熟肽中。

圖2 三次PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳

2.2 pPICZαA-ptlyC的鑒定和甲醇利用型高拷貝酵母轉化子的篩選

重組表達載體pPICZαA-ptlyC的構建如圖3-B所示。采用XhoI和XbaI對其進行雙酶切后，瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，在接近理論分子量657 bp處有一個明顯的條帶（圖4）；此外，DNA測序結果也證明ptlyC與pPICZαA正確連接。

圖3 目的基因ptlyC的核苷酸及其推斷的氨基酸序列（A）和重組表達載體的構建（B）

圖4 重組表達載體pPICZαA-ptlyC的雙酶切驗證

上述pPICZαA-ptlyC電轉至畢赤酵母感受態細胞，通過含500 μg/mL博來霉素的YPD和MM平板篩選，得到9株長勢良好的酵母轉化子；以它們的基因組DNA為模板，采用載體上醇氧化酶AOX1基因的通用引物5′AOX1和3′ AOX1進行PCR擴增，結果（圖5）顯示：9株酵母菌均在1 153 bp和近2 000 bp處有明顯條帶，前者為預期的理論分子量位置，證明目的基因ptlyC被成功嵌合進pPICZαA載體；后者為畢赤酵母X-33基因組中也存在醇氧化酶AOX1基因的該兩個引物結合位點而擴增的條帶。但含pPICZαA的酵母轉化子（陰性對照）則未見此條帶。

2.3 重組ptlyC的表達和純化及其鑒定

挑取篩選到的高拷貝酵母轉化子（圖5，泳道9）于50 mL BMMY培養基中進行誘導表達，結果如圖6 Tricine-SDS-PAGE分析所示，隨著表達時間的延長，培養液上清所顯示的在理論分子量25.3 kD處的條帶逐漸加深，至72 h時最為明顯；而含pPICZαA空載體的酵母轉化子的培養液上清中未發現該分子量的條帶。此結果初步證明重組ptlyC在畢赤酵母X-33中得到成功表達。

圖5 高拷貝酵母轉化子的PCR鑒定

圖6 培養液上清的Tricine-SDS-PAGE分析

進一步對上述菌株擴大培養后的培養液上清進行IMAC法純化，得到的純化產物經Western blot分析顯示（圖7），在近27 kD處有明顯條帶，證明該純化產物與抗His的鼠單克隆抗體成功雜交；經BCA法測定，純化產物的濃度為0.21 mg/mL。由于在轉膜過程中蛋白質條帶可能會發生偏移，以致條帶的位置稍偏高。而陰性對照則未見任何條帶。Western blot的分析結果進一步證明了重組ptlyC在畢赤酵母X-33中得到成功表達。

2.4 重組ptlyC的抑菌活性

通過菌落計數法考察含重組ptlyC的培養液上清對枯草芽孢桿菌的抑菌活性，結果如圖8-A所示，濃縮30倍的培養液上清（總蛋白質濃度1.9 mg/mL）顯示了對枯草芽孢桿菌的明顯的抑菌活性。

圖7 純化產物的Western blot分析

圖8 含重組ptlyC的培養液上清（A）和純化的ptlyC（B）的抑菌活性

另一方面，通過瓊脂糖凝膠擴散法考察了純化后的重組ptlyC的抑菌活性，結果如圖8-B所示，分別涂有枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌和副溶血性弧菌的平板上的孔經純化后的重組ptlyC處理后，均顯示了明顯的抑菌圈；涂有沙門氏菌的平板雖然菌落分布密集，但亦可辨明有依稀可見的抑菌圈；而用洗脫緩沖液處理的孔則無明顯的抑菌圈，由此證明重組ptlyC具有良好的抑制革蘭氏陽性和陰性細菌的活性。

3 討論

本研究通過RT-PCR獲得編碼三疣梭子蟹C型溶菌酶成熟肽的cDNA片段“ptlyC”，并成功構建重組表達載體pPICZαA-ptlyC，電轉入畢赤酵母X-33后，在誘導表達階段，分別使用了以YNB（無機氮）作為氮源的BMM培養基（結果未顯示）和有機氮（酵母粉和蛋白胨）作為氮源的BMMY培養基，結果顯示基于BMMY培養基培養的菌體的長勢及重組蛋白的表達情況更好，因此在后續的擴大培養中使用BMMY培養基進行誘導表達。然而，根據純化產物的蛋白質濃度估算得到的重組ptlyC的表達量低于1 mg/L，導致如此低的表達量的原因可能與本研究使用的天然cDNA有關，經JAVA Codon Adaption Tool（http://www.jcat.de/Start.jsp）檢測，“ptlyC”基因中有80個屬于低頻密碼子（相對適應性低于0.1）。李兵等［30］報道了經密碼子優化后在畢赤酵母中表達的重組體黑曲霉阿魏酸酯酶活性較天然cDNA表達的重組蛋白提高了近6倍；Inouye等［31］的研究表明根據人類密碼子偏愛性對螢火蟲熒光素酶進行密碼子優化后，顯著提高了其在哺乳動物細胞中的表達水平。因此，進一步的研究將聚焦于對“ptlyC”基因進行密碼子優化后的重組DNA表達。

為方便純化和Western blot分析，本研究設計的重組蛋白在其N端含6×His標簽，但無論含重組ptlyC的培養液上清還是純化的重組ptlyC均顯示了抑菌活性，說明N端的6×His標簽并不影響重組蛋白的生物學活性；此結果與舒正玉［32］報道的黑曲霉F044脂肪酶基因在大腸桿菌BL21（DE3）和畢赤酵母GS115中表達的結果是一致的，他同樣設計了N端含6×His標簽的重組蛋白，經大腸桿菌和畢赤酵母表達的重組F044脂肪酶均具有較高的酶活力。值得注意的是，純化的重組ptlyC除了顯示對革蘭氏陽性的枯草芽孢桿菌有抑菌活性之外，還對革蘭氏陰性的銅綠假單胞菌、副溶血性弧菌和沙門氏菌具有較明顯的抑菌活性；張輝等［8］報道的通過原核表達系統獲得的重組三疣梭子蟹C型溶菌酶則具有抑制革蘭氏陰性的溶藻弧菌、哈維氏弧菌和鰻弧菌的活性。而馮亞東等［29］報道的通過畢赤酵母表達系統獲得的重組斑點叉尾鮰C型溶菌酶僅顯示對于枯草芽孢桿菌的抑菌活性。三疣梭子蟹與魚類在C型溶菌酶抑菌譜方面的差異可能源于兩者來源的C型溶菌酶在結構上的差異，這種差異與兩者分屬不同的物種有關，前者為甲殼類動物，而后者屬于硬骨魚類，它們在免疫機制方面存在的客觀差異可能導致作為免疫因子的C型溶菌酶在結構和功能上的差異。該方面的研究工作還有待于進一步深入。本研究建立的畢赤酵母表達系統為進一步開發甲殼動物來源的天然抗菌劑奠定了重要的研究基礎。

4 結論

本研究建立了基于畢赤酵母表達系統的三疣梭子蟹C型溶菌酶的制備方法，其最適的表達條件為：在BMMY培養基中，28℃、250 r/min、pH6.0、1%甲醇，培養72 h。經Tricine-SDS-PAGE分析，重組ptlyC的分子量接近預期的理論分子量（25.3 kD）。抑菌實驗證明，重組三疣梭子蟹C型溶菌酶具有抑制革蘭氏陽性的枯草芽孢桿菌和革蘭氏陰性的銅綠假單胞菌、副溶血性弧菌和沙門氏菌的活性。