重組中東呼吸綜合征病毒刺突蛋白S1亞基及其編碼DNA接種小鼠的抗血清水平研究

張倩倩 劉康泰 韓宗晟 李榮貴

（1. 青島大學生命科學學院，青島 266071；2. 中國醫(yī)學科學院基礎(chǔ)醫(yī)學研究所，北京 100005）

中東呼吸綜合征（Middle East respiratory syndrome，MERS）是一種新型的冠狀病毒引發(fā)的急性、高致命性的呼吸道傳染性疾病。中東呼吸綜合征冠狀病毒（Middle East respiratory syndrome coronavirus，MERS-Co V）能夠感染人類和動物，引發(fā)呼吸道感染，伴發(fā)多器官功能衰竭等一系列疾?。?］。該病毒于2012年首次在中東沙特阿拉伯地區(qū)被發(fā)現(xiàn)，2013年世界衛(wèi)生組織（WHO）命名該種傳染性疾病為“中東呼吸綜合征”（MERS）［2-3］。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計資料顯示，自2012 年發(fā)現(xiàn)MERS-Co V 至今，全球檢測出MERS-Co V 病毒感染的病例與日趨增，且致死率極高。病例主要集中在中東地區(qū)，但在西亞、歐洲、非洲和北美洲等地區(qū)也有發(fā)現(xiàn)，病史記錄表明中東地區(qū)以外國家報告的原發(fā)病例均有與中東通過商務(wù)、宗教、旅游等不同形式的密切交流史［4］。蝙蝠可能是MERS-Co V的天然儲庫，并在傳播中起關(guān)鍵作用［5-6］。另外，根據(jù)研究報道，駱駝也是MERS-Co V的重要儲庫寄主，它們似乎是導致人類感染的唯一動物宿主［7］。

MERS-Co V 是由一條正鏈 RNA 組成、具有包膜的β 型冠狀病毒，其基因組全長30 kb，編碼多種結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白［8］。其中刺突蛋白（Spike，S）是病毒表面重要的結(jié)構(gòu)蛋白之一，在侵染靶細胞過程中起重要作用。MERS-Co V的S蛋白是I型跨膜糖蛋白，包含1 353個氨基酸殘基，主要由S1亞基和S2亞基構(gòu)成，并以三聚體狀態(tài)呈現(xiàn)在病毒表面。MERS-Co V利用二肽基肽4（ Dipeptidyl peptidase-4，DPP4，也稱為CD26）作為其在宿主細胞上的受體［9-10］。MERS-Co V S1亞 基 的 C 端 含 有 結(jié) 合DPP4的受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域（Receptor binding domain，RBD），功能是與受體結(jié)合和識別后，介導病毒與靶細胞的結(jié)合［11-14］。S蛋白質(zhì)、S1亞基及S2亞基均是可作為MERS-Co V疫苗研究的主要對象［13］。

現(xiàn)今，尚無臨床驗證有效的抗MERS-Co V的疫苗和治療藥物。大多數(shù)的疫苗和藥物研究仍還只停留在實驗室階段或動物試驗階段，其主要原因是目前對中東呼吸綜合征病毒的傳播途徑和致病性尚未明了，且該病毒的高致病性和危險性，使得人類臨床試驗較難開展。因此，高效抗體的研制，對于中東呼吸綜合征病毒的預(yù)防和控制具有至關(guān)重要的作用。本研究意在克隆MERS-Co V表面刺突S蛋白S1亞基基因，構(gòu)建重組真核表達載體，獲得S1-Fc重組融合蛋白，分別通過克隆了S1亞基基因的重組質(zhì)粒接種，重組S1-Fc融合蛋白接種以及重組質(zhì)粒和重組S1-Fc融合蛋白聯(lián)合接種小鼠，以檢測小鼠是否發(fā)生免疫反應(yīng)，并檢測接種小鼠產(chǎn)生的抗S1血清滴度是否存在區(qū)別，為研制預(yù)防中東呼吸綜合征病毒的疫苗提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株 人胚腎細胞（HEK293E）（中國醫(yī)學科學院基礎(chǔ)醫(yī)學研究所細胞中心）。

1.1.2 菌株與質(zhì)粒 大腸桿菌感受態(tài)（DH5α），購于北京天根有限公司；Peak13CD5LTEVhIgGFc（中國醫(yī)學科學院基礎(chǔ)醫(yī)學研究所蔣澄宇課題組提供）；pcDNA3.1（+）-S質(zhì)粒（蘇州泓迅生物科技有限公司）。

1.1.3 實驗動物 SPF級6-8周齡雌性BALB /C小鼠（編號：ACUC-A02-2017-008，北京藥品生物制品鑒定所實驗動物資源中心）。

1.1.4 試劑耗材 IgG Fc抗體，細胞篩選抗性抗生素Puromycin，弗氏完全佐劑（Sigma公司）；山羊抗小鼠二抗（杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司）；限制性內(nèi)切酶NheI、BamH I、AvrII，T4 DNA 連接酶（New Englan BioLabs公司）；Protein A蛋白柱（GE醫(yī)療集團）；0.45 μm多孔濾膜（Millipore公司）；BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒（天根生化科技有限公司）；1×TMB ELISA Substrate Solution（R&D Systems）；5 mL EDTA抗凝采血管（BD公司）；Opti-MEM?I Reduced Serum Medium（1X）liquid（cat. no. 31985-062），DMEM液體培養(yǎng)基，胎牛血清（Invitrogen公司）；脂質(zhì)體NeofectTMDNA transfection reagent（零客創(chuàng)智北京生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 Peak13CD5LS1TEVhIgGFc質(zhì)粒的構(gòu)建 MERS Co V表面刺突蛋白（S）基因來源于從NCBI基因數(shù)據(jù)庫（登錄號：KF961222.1），共編碼1 353個氨基酸，S1為S蛋白的亞基，共編碼751個氨基酸。首先通過替換高頻密碼子的方法進行序列優(yōu)化，再用次高頻密碼子替換序列中間可能出現(xiàn)的NheⅠ、BamH Ⅰ、EcoR Ⅰ及NotⅠ酶切位點；最后將S基因的核苷酸序列的前后兩端連接上NheⅠ、BamH Ⅰ、EcoR Ⅰ及NotⅠ 酶切位點，由蘇州泓迅生物科技有限公司合成。將合成的S基因作為模板，采用PCR擴增、純化、回收S1基因片段，通過BamH Ⅰ和NheⅠ限制性內(nèi)切酶雙酶切后插入Peak13CD5LTEVhIgGFc真核表達載體，構(gòu)建Peak13CD5LS1TEVhIgGFc重組質(zhì)粒，并添加便于蛋白純化的Fc標簽，克隆片段通過序列分析進行驗證。

1.2.2 穩(wěn)定表達克隆細胞株的構(gòu)建與重組蛋白的純化 重組Peak13CD5LS1TEVhIgGFc質(zhì)粒用AvrⅡ酶切線性化后純化回收，用脂質(zhì)體（NeofectTM DNA transfection reagent）轉(zhuǎn)染至HEK293E細胞中。轉(zhuǎn)染48 h后，將其換至終濃度分別為0.6 μg/mL、0.8μg/mL、1.0 μg/mL 和 1.2 μg/mL 嘌呤霉素藥物培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)，3-4 d后將存活的轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的細胞轉(zhuǎn)至新的細胞培養(yǎng)液中，繼續(xù)加入高濃度嘌呤霉素藥物培養(yǎng)，并挑選單個細胞轉(zhuǎn)至96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)。培養(yǎng)7 d后，取克隆細胞株的上清液進行Western blotting檢測，分析不同克隆細胞株的融合蛋白表達情況，將篩選出的高表達融合蛋白的陽性克隆細胞株進行擴增培養(yǎng)。

陽性克隆細胞株大量擴增培養(yǎng)2-3 d后，回收細胞上清液，4℃，4 000 r/min離心30 min，取上清，采用0.45 μm濾膜進行過濾。重組S1-Fc融合蛋白利用Protein A親和柱進行純化，同時，AcTEV 蛋白酶切重組S1-Fc融合蛋白，酶切后的蛋白溶液流過Protein A親和柱，收集流出液獲得切除Fc標簽的S1蛋白。向純化的蛋白溶液中添加苯甲基磺酰氟（Phenylmethanesulfonane fluoride，PMSF）與二硫蘇糖醇（ Dithiothreitol，DTT）至終濃度分別為1.0 mmol/L，超濾濃縮后，進行SDS-PAGE與Western blotting分析，用BCA法來測定蛋白濃度，蛋白保存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 動物接種 取6-8周齡的BALB /C小鼠，隨機分為4組，每組5只。其中，第1組，每只小鼠腹腔注射20 μg 重組S1-Fc融合蛋白與等體積的弗氏完全佐劑的混合物；第2組，每只小鼠后腿肌肉內(nèi)側(cè)注射100 μg 重組Peak13CD5LS1TEVhIgGFc質(zhì)粒；第3組，每只小鼠腹腔注射20 μg 重組S1-Fc融合蛋白與等體積的弗氏完全佐劑的混合物，同時后腿肌肉內(nèi)側(cè)注射100 μg重組 Peak13CD5LS1TEVhIgGFc質(zhì)粒；第4組，小鼠腹腔注射200 μL生理鹽水作為對照組。每隔1周用同樣劑量的樣品再次接種，共接種3次，每次接種1周后小鼠尾靜脈取血，4℃，2 000 r/min離心10 min，分離血清并保存于-80℃。

1.2.4 Western blotting驗證接種小鼠是否產(chǎn)生抗S1血清 將不同接種方式接種28 d后獲得的小鼠血清分別稀釋成1 000倍和2 000倍，以10 pmol和1 pmol重組 S1-Fc融合蛋白作為抗原，通過Western blotting檢測接種小鼠血清中是否存在抗S1血清。以人源IgG Fc抗體作為抗S1血清的陽性對照，埃博拉病毒GP1-Fc融合蛋白作為抗原的陰性對照。

1.2.5 ELISA檢測抗S1血清的滴度 用PBS將抗原（重組S1-Fc融合蛋白）稀釋成50 μg/mL的包被液，包被96孔酶標板，每孔100 μL，4℃冷室靜置過夜，移去包被液，用PBS清洗檢測板3次，3 min/次；用pH 7.4，5%濃度的 BSA進行室溫封閉，1 h后移去封閉液，用PBS清洗檢測板3次，3 min/次；用人源IgG Fc抗體作為抗S1血清陽性對照，取接種生理鹽水組小鼠的血清作為抗S1血清陰性對照，將接種小鼠血清以1∶500開始采用pH7.4，含5% 濃度BSA的PBS梯度稀釋，室溫孵育2 h。移去待測抗S1血清，用PBS清洗檢測板3次，3 min/次；加入1∶10 000稀釋的辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠IgG抗體，室溫孵育2 h，移去山羊抗小鼠IgG抗體，用PBS清洗檢測板3次，3 min/次；加入100μL 1×YMB ELISA Substrate Solution于室溫下避光顯色反應(yīng)5 min，5 min后每孔加入50 μL終止液終止反應(yīng)。于450 nm波長處測定吸光度值，630 nm作為參考波長。采用單因素方差分析組內(nèi)樣本間顯著性，P＜0.05為差異顯著，采用GraphPad Prism 7 軟件作圖。

2 結(jié)果

2.1 包含MERS-Co V S1基因的Peak13重組表達載體的構(gòu)建及酶切鑒定

用限制性內(nèi)切酶NheI和BamHI雙酶切鑒定克隆了MERS-Co V S1基因的Peak13CD5LTEVhIgGFc重組質(zhì)粒，結(jié)果如圖1所示，克隆片段大小符合插入目的基因的大小，DNA測序結(jié)果證實MERS-Co V S1基因序列成功插入了載體的正確位置，且沒有突變發(fā)生。

圖1 重組表達質(zhì)粒pEAK13CD5LS1TEVhIgGFc的雙酶切鑒定

2.2 重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染及重組蛋白的表達與純化

采用限制性內(nèi)切酶AvrⅡ酶切Peak13CD5LS1TEVhIgGFc重組質(zhì)粒，使其線性化，載體與切下條帶已完全分開，切膠純化回收線性化質(zhì)粒載體。用脂質(zhì)體（NeofectTM DNA transfection reagent）線性化重組質(zhì)粒至已長至80%的HEK293E細胞。將轉(zhuǎn)染后的細胞轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)液，并加入不同濃度的嘌呤霉素以篩選穩(wěn)定表達的克隆細胞株。終濃度為0.8 μg/mL嘌呤霉素篩選得到的克隆細胞株表達量最高，大規(guī)模的培養(yǎng)0.8 μg/mL嘌呤霉素篩選得到的穩(wěn)定表達的克隆細胞株。利用Protein A親和柱對細胞培養(yǎng)液中的重組進行S1-Fc融合蛋白進行純化?？捡R斯亮藍染色結(jié)果（圖2）顯示，純化獲得蛋白大小為122 kD，與預(yù)期的重組S1-Fc融合蛋白的大小一致。

圖2 重組S1-Fc融合蛋白純化的SDS-PAGE分析

2.3 Western blotting分析接種小鼠S1血清的滴度及特異性

分別接種了重組Peak13CD5LS1TEVhIgGFc質(zhì)粒、重組S1-Fc融合蛋白、重組S1-Fc融合蛋白和重組Peak13CD5LS1TEVhIgGFc質(zhì)粒3次后的小鼠，尾靜脈取血并分離血清，按照1∶1 000和1∶2 000的稀釋條件下檢測10 pmol和1 pmol的S1-Fc融合蛋白抗原。結(jié)果（圖3-A）顯示，3種不同接種方法均可以誘導小鼠產(chǎn)生抗S1血清，但不同的方法誘導的抗S1血清濃度存在差異。接種重組S1-Fc融合蛋白及同時接種S1-Fc融合蛋白和重組Peak13CD5LS-1TEVhIgGFc質(zhì)粒的小鼠血清在1∶1 000的稀釋條件下可以通過Western blotting法明顯檢測10 pmol和1 pmol的S1-Fc融合蛋白抗原，但僅接種了重組Peak13CD5LS1TEVhIgGFc質(zhì)粒小鼠所取得血清與10 pmol 重組S1 -Fc融合蛋白抗原可以明顯反應(yīng)，但與1 pmol S1-Fc融合蛋白抗原反應(yīng)較弱。

接種重組S1-Fc融合蛋白及同時接種重組S1-Fc融合蛋白和重組Peak13CD5LS1TEVhIgGFc質(zhì)粒小鼠的血清在1∶2 000稀釋條件下可以通過Western blotting法明顯檢測到與10 pmol的S1-Fc融合蛋白抗原的反應(yīng)條帶，與1 pmol重組 S1-Fc融合蛋白反應(yīng)較弱，而僅接種了重組Peak13CD5LS1TEVhIgGFc質(zhì)粒所取得的小鼠血清在1∶2 000的稀釋條件下能與10 pmol S1-Fc融合蛋白輕微反應(yīng)，完全檢測不到與1 pmol 重組S1-Fc融合蛋白的反應(yīng)（圖3-B）。因此，重組S1-Fc融合蛋白接種和重組S1-Fc融合蛋白及重組Peak13CD5LS1TEVhIgGFc質(zhì)粒聯(lián)合接種小鼠的免疫效果明顯優(yōu)于單純只接種重組Peak13CD5LS1TEVhIgGFc質(zhì)粒的免疫效果。

圖3-C結(jié)果顯示，接種重組S1-Fc融合蛋白后的小鼠抗血清在1∶1 000的稀釋條件下通過Western blotting法檢測只能特異性的檢測到重組S1-Fc融合蛋白和S1蛋白，無法與埃博拉GP1-Fc融合蛋白發(fā)生反應(yīng)。而在相同條件下，IgG Fc抗體能夠明顯檢測到10 pmol和1 pmol的重組S1-Fc融合蛋白。說明接種小鼠體內(nèi)產(chǎn)生了抗S1蛋白的特異性抗體。

圖3 Western blotting分析接種小鼠的抗S1-Fc抗血清滴度與特異性

圖4 初次接種不同時間小鼠抗血清的ELISA檢測

2.4 ELISA檢測小鼠免疫后抗S1血清滴度

小鼠接種不同成分后定期取血并分離血清，用純化的S1-Fc融合蛋白作為抗原，ELISA檢測接種小鼠血清中抗S1血清的滴度。從圖4可以看出，接種7 d后，質(zhì)粒Peak13CD5LS1TEVhIgGFc接種組小鼠的血清中均未檢測出抗S1血清，接種14 d后出現(xiàn)了少量抗S1血清，但與對照組比濃度未達到顯著水平，接種28 d后，該組小鼠血清中才出現(xiàn)了顯著高于對照組的抗S1血清濃度（P＜0.05）。而重組S1-Fc融合蛋白接種組、重組S1-Fc融合蛋白和重組Peak13CD5LS1TEVhIgGFc聯(lián)合接種組小鼠在接種7 d后均產(chǎn)生了明顯的抗S1血清，接種21 d后，兩組小鼠血清中抗S1血清滴度達到極高的水平，極顯著的高于對照組（P＜0.0001）。接種重組S1-Fc融合蛋白與共同接種重組S1-Fc融合蛋白和重組Peak13CD5LS1TEVhIgGFc組的數(shù)值未見顯著差異，故而兩者的接種效果相同，但該兩種接種方法產(chǎn)生的抗S1血清滴度高于只接種重組Peak13CD5LS1TEVhIgGFc的數(shù)值。因此，在短期內(nèi)為達到高水平抗S1血清應(yīng)答，綜合考慮成本等因素，接種重組S1-Fc融合蛋白的效果較好。

3 討論

刺突蛋白是中東呼吸綜合征病毒表面重要的結(jié)構(gòu)蛋白之一。S蛋白在病毒的吸附和穿入過程中發(fā)揮著重要作用，是MERS-Co V疫苗研究的主要靶抗原［13，15-16］。在感染過程中，MERS-Co V的S蛋白被切割成受體結(jié)合亞基 S1 和膜融合亞基 S2［12，17-19］。MERS-Co V S1亞基含有與宿主細胞表面蛋白二肽基肽酶4（DPP4）的受體結(jié)合的結(jié)構(gòu)域（RBD），介導病毒與靶細胞的結(jié)合［12，15，17，23］，引導 MERSCo V進入宿主細胞。MERS-Co V RBD可以結(jié)合包括人，駱駝，白鼬和蝙蝠等在內(nèi)的不同宿主細胞的DPP4。但MERS-Co V的易感性與宿主物種存在極大關(guān)系［6，20-21］。

本文通過比較研究了接種重組S1-Fc融合蛋白、重組質(zhì)粒Peak13CD5LS1TEVhIgGFc以及二者聯(lián)合接種小鼠的抗S1血清水平，證實3種接種方式均可誘導小鼠產(chǎn)生抗S1血清，接種重組S1-Fc融合蛋白組和聯(lián)合接種重組S1-Fc融合蛋白和重組質(zhì)粒Peak13CD5LS1TEVhIgGFc組小鼠產(chǎn)生了高水平的抗S1血清，而只接種重組質(zhì)粒Peak13CD5LS1TEVhIg-GFc組的小鼠的抗S1血清水平明顯不如前兩者高。其原因可能是單純的重組質(zhì)粒接種小鼠后，小鼠體內(nèi)并不存在質(zhì)粒DNA的主動運輸過程，即重組質(zhì)粒不能主動進入細胞，而重組質(zhì)粒必須輸?shù)郊毎藘?nèi)才能被轉(zhuǎn)錄成mRNA，進而誘導小鼠產(chǎn)生對該抗原蛋白的體液免疫和細胞免疫，小鼠體內(nèi)合成抗原蛋白需要一定時間過程［22］。因此，短時間內(nèi)DNA接種所激發(fā)的免疫反應(yīng)強度相對較弱，不足以引起足夠的免疫保護效果，在小型動物的試驗中可能會檢測到免疫反應(yīng)，但會因?qū)嶒瀯游矬w型的增大，而DNA接種的免疫效果會降低，尤其對人類以及大動物的免疫實驗［24］。

此外，DNA接種免疫存在一定的不安全性，DNA接種的導入有可能會發(fā)生基因整合，激活內(nèi)源性原癌基因，或誘發(fā)染色體的不穩(wěn)定性，產(chǎn)生遺傳性或致癌反應(yīng)，該方法更適合在體外難以表達的蛋白，較多的適用于小型動物［24-26］。蛋白質(zhì)疫苗抗S1血清稀釋1∶2 000時仍能夠很好的檢測到1 pmol的S1-Fc抗原蛋白，結(jié)果顯示蛋白疫苗產(chǎn)生體液免疫的免疫效果更為快速，該蛋白質(zhì)疫苗在MERS CoV研究中具有潛在的應(yīng)用價值。

4 結(jié)論

本研究構(gòu)建了高效表達重組S1-Fc融合蛋白的重組Peak13CD5LS1TEVhIgGFc質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染HEK293E細胞后獲得了可穩(wěn)定表達重組S1-Fc融合蛋白的克隆細胞株，并通過Protein A親和柱純化獲得了高濃度的重組S1-Fc融合蛋白。小鼠分別接種重組S1-Fc融合蛋白、重組質(zhì)粒Peak13CD5LS1TEVhIgGFc以及重組S1-Fc融合蛋白和Peak13CD5LS1TEVhIgGFc后，在小鼠血清中均檢測到了特異性抗S1血清。但僅接種重組質(zhì)粒的小鼠體內(nèi)在第3次接種后才產(chǎn)生較高濃度的抗S1血清，而兩種包含S1-Fc融合蛋白的接種方式在首次注射后就出現(xiàn)了高滴度的抗S1血清，而且顯著高于只接種了重組Peak13CD5LS1TEVhIgGFc質(zhì)粒小鼠的抗S1血清水平。