一株黃色桿菌的分離鑒定及對鄰苯二甲酸酯的降解研究

王嘉翼 樊雙虎 任超 王俊歡 楊婷 賈陽 李先軍 閆艷春

（中國農業科學院研究生院，北京 100081）

鄰苯二甲酸酯（Phthalic acid eaters，PAEs）是一類重要的工業原料，常見的PAEs包括鄰苯二甲酸二甲酯（Dimethyl phthalate，DMP）、鄰苯二甲酸二乙酯（Diethyl phthalate，DEP）、鄰苯二甲酸二丁酯（Dibutyl phthalate，DBP）、鄰苯二甲酸二辛酯（Dioctyl phthalate，DOP）、鄰苯二甲酸甲苯基丁酯（Butyl benzyl phthalate，BBP）和鄰苯二甲酸二乙基己酯（di-2-ethylhexyl phthalate，DEHP）。PAEs主要用作增塑劑，以增強塑料制品的柔韌性、可塑性和耐用性，此外還用作油漆、化妝品、殺蟲劑等中的化學添加劑［1-2］。在塑料中，PAEs與塑料基質并非以共價鍵的形式結合，因此在塑料的在生產、使用和廢物處理過程中，PAEs會從塑料中滲漏并進入環境［3］。DBP作為一種被廣泛應用在實際生活中的鄰苯二甲酸酯，環境中也是普遍存在。DBP在水中和和沉淀物中的濃度范圍分別為1.0-13.5 μg/L和0.3-30.3 μg/g［4］。大量研究表明，PAEs具有環境雌激素效應，影響人體和動物的內分泌系統。PAEs還具有致畸致癌致突變的“三致效應”，主要表現在肝臟毒性、生殖毒性方面，如DBP可誘發肝細胞癌變。體外研究表明，DBP和BBP能抑制胚胎肢芽細胞的生長和分化，對成熟的大鼠和魚類有抗雄性激素和抗雌性激素的作用［5］。目前，DMP，DEP，BBP，DBP，DOP 和 DEHP 已被美國環保局（EPA）列為優先控制的污染物。

PAEs在自然環境中極難降解，DEHP在環境中的半衰期長達2000年。PAEs 通過非生物途徑降解如光解和水解的速度都很慢，且對環境造成二次污染。微生物代謝是一個酶促反應過程，對PAEs降解速率快，成本低，無二次污染，是PAEs 降解的主要途徑。因此，PAEs 高效降解菌株的篩選對消除PAEs環境污染具有重要意義［6］。目前，許多學者已經從受污染的土壤、污泥等環境中分離純化到大量的能快速降解PAEs的微生物。本實驗室分離的戈登氏菌（Gordoniasp.）YC-RL2和分支桿菌（Mycobacteriumsp.）YC-RL4高 效 降 解 DEHP、DBP、BBP和DCHP等多種PAEs，質譜分析表明菌株通過酯鍵的逐步水解將PAEs轉化成鄰苯二甲酸單酯、鄰苯二甲酸（Phthalic acid，PA）［7-8］。陳濟安等［9］從活性污泥中分離的Microbacteriumsp. strain CQ0110Y，能將濃度在1 350 mg/L及以下的DEHP在10 d內完全降解，當濃度提高到2 000 mg/L時，10 d內DEHP的降解率在85%以上。

DBP是生活中應用最廣泛的增塑劑之一，實驗以DBP作為底物從受石油污染的土壤中分離到一株DBP降解菌，研究了溫度，pH和鹽度對其降解能力的影響，確定降解的最適條件。通過降解產物的確定，分析確定菌株對DBP的基本代謝途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗土壤樣品采集與處理 土壤樣品采集于受石油嚴重污染的土壤中，采樣前對采樣的玻璃器皿進行清洗并121℃高溫高壓滅菌20 min。用鋼鏟除去各個采樣點上層15 cm的土層后取樣，樣品內同時含有水樣和土壤樣品。將所有采樣點的樣品混合裝入已滅菌的玻璃器皿中密封，放置在裝有冰袋的保溫箱中，并于24 h內運回實驗室，放入冰箱4℃保藏。

1.1.2 藥品與實驗試劑 該實驗中所使用的化學藥品均為分析純，DBP等其他鄰苯二甲酸酯購自于國藥集團化學試劑北京有限公司；甲醇為HPLC級，購自于Fisher 公司；胰蛋白胨、酵母提取物購自于Oxiod 公司；NaCl等無機鹽試劑，購自于國藥集團化學試劑北京有限公司；基因組提取試劑盒、純化試劑盒、rTaq 酶及核酸Marker購自于TaKaRa 公司；熒光核酸染料，購自于北京全式金生物技術有限公司；瓊脂糖購自于天根生化科技（北京）有限公司；引物合成與測序均送往上海生工生物公司。

1.1.3 培 養 基 Luria-Bertani培 養 基（LB，pH 7.0）含有胰蛋白胨10.0 g/L，酵母提取物5.0 g/L，NaCl 10.0 g/L。無機鹽培養基（TEM pH 7.0）含有（NH4）2SO42.0 g/L，Na2HPO4·12H2O 1.5 g/L，KH2PO41.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，CaCl2·2H2O 0.01 g/L，微量元素溶液100 μL/L。微量元素溶液配置方法如下：將FeSO4·7H2O 5 g，ZnSO4·7H2O 0.22 g，CuSO4·5H2O 0.03 g，MnSO4·2H2O 1.43g，CoSO4·7H2O 0.12 g，Na2MoO4·2H2O 0.02 g，Na2WO4·2H2O 0.23 g溶于100 mL H2O。LB和TEM固體培養基按1.5%添加瓊脂粉，所有的培養基都應121℃高溫高壓滅菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 DBP降解菌株的篩選與形態特征 將DBP溶于甲醇中，配制成20 g/L的母液。在250 mL的錐形瓶中加入TEM液體培養基100 mL，土壤樣品5 g，DBP濃度為100 mg/L。置于恒溫振蕩器中150 r/min、30℃培養5 d。將上述培養液按2%重新接至含有100 mg/L DBP的TEM液體培養基中，同條件培養5 d。重復進行5次富集，DBP的濃度保持不變。

取150 μL最終富集的培養液在含有100 mg/L DBP 的TEM固體培養基上均勻涂布，平板放置于30℃培養箱培養，直至長出單菌落。分別挑取表型不同的單菌落于含有100 mg/L DBP的TEM固體培養基上，進行劃線分離，重復劃線至TEM固體培養基上出現形態特征一致的單菌落，平板4℃保存備用。挑取單菌落接入含有100 mg/L DBP的TEM液體培養基中培養至對數期，加入30%甘油，-80℃冰箱保存備用。挑取單菌落接入含有100 mg/L DBP的LB液體培養基中，培養24 h，經固定液處理后用于掃描電鏡觀察。

觀察菌落的形態及特征，根據伯杰氏細菌鑒定手冊，對分離到的DBP降解菌株進行生理生化實驗［10］。

1.2.2 16S rDNA 序列分析 采用試劑盒提取細菌基因組DNA，用通用引物27F（5′-AGTTTGACMTGGCTCAG-3′）和 1492R（5′-CGGTTACCTTGTTACGACTT-3′）對16S rDNA 進行PCR擴增。PCR擴增體系如下：PCR premix buffer（TaKaRa）25 μL，正反向引物各 1.5μL，ddH2O 20 μL 和 2 μL 的細菌基因組 DNA。PCR循環參數如下：94℃預變性5 min，94℃變性1 min，56℃退火45 s，72℃延伸90 s，上述循環重復34次，最后一次延伸10 min。

PCR產物純化之后與pEASY-T1 克隆載體連接，連接體系如下：PCR產物4 μL，p-EASY-T1載體1 μL混合均勻后，放置37℃金屬浴反應10 min。將連接產物加入至DH5α感受態細胞中，輕彈混勻，冰浴30 min。42℃金屬浴熱激60 s，冰浴2 min。加入500 μL平衡至室溫的LB培養基，180 r/min，37℃培養 1 h。取 16 μL 250 mmol/L IPTG 和 40 μL 20 mg/mL X-gal混合，均勻涂在LB平板上，待全部吸收后，再將200 μL菌液均勻地涂在平板上，37℃培養箱中過夜培養。次日，挑取白斑送至生工測序公司進行測序。測序結果提交至GenBank（NIH，Bethesda，MD，USA）并用BLAST將其與GenBank已知序列進行比對，并用MEGA 7.0 軟件構建系統發育樹。

1.2.3 菌株YC-JY1對DBP的降解驗證 根據已有文獻報道，將起始溫度設為30℃，培養基的pH設為7.0。將單菌落接種至含有100 mg/L DBP的LB培養基中擴大培養至OD600=0.6-1.0，取出1 mL 菌液12 000 r/min 離心2 min，用TEM液體培養基（pH 7.0）吹打清洗兩次。為驗證菌株YC-JY1以DBP作為唯一的碳源進行生長，將菌株YC-JY1以2%接菌量分別接至不添加任何碳源的TEM液體培養基中和只有甲醇為唯一碳源的TEM液體培養基中。再以同樣的接菌量接入至含有100 mg/L DBP 的10 mL TEM液體培養基中，150 r/min、30℃培養5 d，未接菌的樣品作為空白對照。驗證菌株YC-JY1能夠以DBP作為唯一碳源并測定菌株YC-JY1的生長曲線及其對DBP的降解率。

1.2.4 DBP降解的最適條件 為測定pH對菌株YCJY1降解DBP的影響，培養溫度初始設為30℃，pH 2.0-13.0。將菌株YC-JY1按2%接菌量接入含有100 mg/L DBP的10 mL TEM液體培養基中，150 r/min培養5 d，未接菌的樣品作為空白對照，每個pH設置5個重復。5 d后氣相色譜儀（GC）測DBP的含量，計算降解率，確定最適pH。在最適pH條件下，溫度設置為15-40℃，每5℃為一個梯度，培養方式與上述方法相同，確定菌株最適的降解溫度。

1.2.5 NaCl含量對菌株YC-JY1降解DBP的影響 添加NaCl（含量為0%、2%、4%、6%、8%和10%）至含有100 mg/L DBP的TEM液體培養基中。將菌株YC-JY1按2%接菌量接入培養基中，最適條件下，150 r/min培養5 d，未接菌的樣品作為空白對照，考查鹽度對菌株降解能力的影響。

1.2.6 菌株YC-JY1對DBP的最大耐受濃度 將菌株按2%的接菌量接入10 mL TEM液體培養基中，同時分別加入100 mg/L、200 mg/L、300 mg/L、400mg/L、500 mg/L、600 mg/L、700 mg/L、800 mg/L、900 mg/L和1 000 mg/L不同濃度的DBP作為底物。最適條件下，150 r/min培養5 d，未接菌的樣品作為空白對照。

1.2.7 菌株YC-JY1對其他PAEs的利用 為檢測菌株YC-JY1對不同PAEs的利用能力，讓其在分別含有以下PAEs的培養基中培養，作為底物的PAEs為：鄰苯二甲酸二丙酯（DPrP）、DBP、DPeP、DHP、鄰苯二甲酸二庚酯（DHPP）、DOP、鄰苯二甲酸二壬酯（DNP）、鄰苯二甲酸二癸酯（DDP）、DCHP、BBP，濃度均為100 mg/L。接菌量仍為2%，在最適條件下，150 r/min培養5 d，每種底物設置5個重復，未添加菌株的樣品作為空白對照。記錄培養基中菌株YC-JY1的生長情況，有明顯生長記作（+ +），不明顯生長記作（+）。

1.2.8 DBP代謝產物的確定和代謝途徑的推測 DBP的中間代謝產物通過HPLC-MS分析，并由此推測菌株YC-JY1對DBP的代謝途徑。以2%接菌量接入含有100 mg/L DBP的10 mL的TEM液體培養基中，最適條件下，150 r/min培養3 d，設置3個重復。3 d后，處理樣品并用于HPLC-MS分析。

1.2.9 PAEs的分析方法 所有的降解實驗均在5 d后使用GC測定樣品中的PAEs殘留量。樣品中加入等體積的正己烷，搖晃震蕩1 min。待水相與有機相分離后，取有機相1 mL于樣品瓶中用于GC分析。

GC分析儀器和參數如下：島津氣相色譜儀2010，FID檢測器，RTX-1301毛細管柱（30.0 m × 0.25mm × 0.25 μm）。載氣為氮氣（純度≥ 99.999%，流速為30 mL/min）；進樣口溫度300℃，柱溫280℃，檢測器300℃；進樣量為1 μL，GC分析軟件（版本2.32.00，SHIMADZU）分析GC檢測結果，計算降解率。

1.2.10 HPLC-MS分析方法 首先用2M HCl對已培養3 d的樣品進行酸化，調至樣品pH 至2.0-3.0。加入等體積乙酸乙酯，搖晃震蕩1 min，待有機相與水相完全分離后，取出全部有機相。氮氣吹直至樣品中乙酸乙酯完全揮發，1 mL 甲醇復溶，經0.22μm濾膜過濾后用于HPLC-MS檢測。

HPLC-MS 儀器與分析參數如下：安捷倫高效液相色譜串聯三重四級桿質譜（HPLC-QQQ，1260-6420）對樣品進行檢測。質譜配置電噴霧電離源（ESI）和Zorbax Eclipse Plus C18 柱，柱溫維持在30℃。流動相是水和甲醇（10∶90），流速 0.2 mL/min，進樣量10 μL，樣品直接進入質譜儀。ESI-MS分析環境如下：載氣（325℃）為高純氮氣（99.999%），流速為 8 L/min，毛細管電壓為3.5 kV。通過負離子掃描模式進行檢測，掃描范圍為 50-400 m/z，通過 Mass hunter（version A.02.00，USA）對結果進行收集及數據分析［11］。

2 結果

2.1 鄰苯二甲酸酯降解菌的分離與形態學特征

經多輪富集和篩選純化，在受石油污染的土壤中分離出一株可利用DBP作為唯一碳源進行生長的菌株。該菌株菌落呈圓形，表面光滑呈黃色，不透明，在平板上生長狀態如圖1所示。通過掃描電鏡觀察，菌株YC-JY1為桿狀，大小約為 （0.36 μm-0.44 μm）×（1.22 μm-1.44 μm）（圖 2）。

圖1 菌株YC-JY1在TEM固體培養基上的生長

圖2 菌株YC-JY1的掃描電鏡照片

提取細菌總DNA 并選用細菌通用引物27F和1 492R擴增16S rDNA 基因，擴增產物序列長度為1 445 bp，如圖3所示。根據測序結果，所獲得的序列提交至GenBank，登錄號為MH152572。利用BLAST 軟件與GenBank 中已登錄的16S rDNA基因序列進行同源性比較，MEGA 7.0 軟件建立系統發育樹，如圖3所示。經過比較，菌株YCJY1與Xanthobacter aminoxidans14a（GenBank：AF399969.1） 和Xanthobacter flavus301（GenBank：X94199.1）具有100% 的同源性，因此確定菌株屬于黃色桿菌屬（Xanthobactersp.）。

2.2 菌株YC-JY1對DBP的降解及生長曲線

如圖4所示，菌株YC-JY1在TEM液體培養基、在只含有甲醇的TEM液體培養基中均無生長；在含有DBP的TEM液體培養基的樣品中，明顯由無色變為淡黃色，生長現象明顯。由此可知，菌株YCJY1可以將DBP作為唯一碳源進行生長。

圖3 菌株YC-JY1的16S rDNA序列分析與系統發育樹的構建

圖4 菌株利用DBP作為唯一碳源的生長

DBP的降解率與菌株YC-JY1的OD600值呈正相關，在5 d內被菌株YC-JY1完全降解（圖5）。

2.3 菌株YC-JY1降解DBP的最適條件

如圖6所示，菌株YC-JY1降解DBP的最適pH為7.0，DBP降解率100%；pH4.0-6.0，DBP的降解率為15%-60%；pH8.0-11.0，DBP的降解率為30%-80%；pH12.0-13.0，DBP的降解率為10%左右；pH2.0-3.0，菌株YC-JY1不降解DBP。數據說明，偏堿性環境更適合菌株YC-JY1降解DBP。

圖5 菌株YC-JY1對DBP的降解和生長曲線

圖6 pH對菌株YC-JY1 降解DBP的影響

如圖7所示，菌株YC-JY1降解DBP的最適溫度為30℃，DBP降解率為100%；20℃-35℃，DBP降解率在40%以上；15℃和40℃，DBP無降解。所有pH，溫度的對照組中，DBP起始濃度與終濃度無明顯變化，菌株YC-JY1無生長跡象。

圖7 溫度對 YC-JY1 降解DBP的影響

2.4 NaCl對菌株YC-JY1降解DBP的影響

DBP的降解率如圖8所示。培養5 d之后，未添加NaCl 的樣品中，DBP被完全降解；NaCl 含量上升到2%時，DBP的降解率迅速下降到35%；NaCl 含量超過2%時，DBP的降解率穩定在10%左右，由此說明菌株YC-JY1并沒有表現出明顯的耐鹽能力。

圖8 NaCl的添加對菌株YC-JY1降解DBP的影響

2.5 菌株YC-JY1對DBP的最大耐受濃度

驗證菌株YC-JY1 對DBP的最大耐受濃度，結果如圖9所示，培養5 d后，100 mg/L 的DBP 能夠被完全降解；200 mg/L-400 mg/L DBP的降解率在94%以上；500 mg/L-1000 mg/L DBP降解率在24%-77%之間。由此可知，菌株YC-JY1對DBP的最大耐受濃度為400 mg/L。對于更高濃度的DBP降解，菌株YC-JY1可能需要更長的時間。

圖9 YC-JY1對DBP的最大耐受度

2.6 菌株YC-JY1的底物譜

菌株YC-JY1在以各種PAEs為底物的TEM液體培養基中的生長情況，如表1所示。

GC 檢測樣品中各種PAEs殘留量，通過計算，得到的降解率如圖10所示。從數據中可以得出，菌株YC-JY1能否降解該底物，與在培養基中的生長情況是相關的。菌株YC-JY1在分別以DBP、DPeP、DHP作為唯一碳源的樣品中，菌株有明顯生長，相應的PAEs降解率在90%以上；在分別以DPrP、DHPP、DOP、DNP、DDP、DCHP、BBP為唯一碳源的樣品中，菌株有生長，但不明顯，此時相應的PAEs降解率在10%-60%。綜上所述可知，菌株的生長與對PAEs降解能力是相符合的。

表1 菌株YC-JY1以PAEs作為底物的生長情況

圖10 YC-JY1 對PAEs的降解

菌株YC-JY1可以利用不同類型的PAEs，具有相對廣泛的PAEs 底物譜。菌株YC-JY1在含有DBP、DPeP、DHP的TEM液體培養基中生長良好，并能夠很好地降解這些底物，說明菌株YC-JY1對具有中長側鏈的PAEs的降解能力要好于具有短側鏈和長側鏈的PAEs。

2.7 菌株YC-JY1降解DBP的代謝途徑推測

通過HPLC-MS分析，將質譜圖所顯示的分子量，與標準化合物標準與技術（NIST，Gaithersburg，MD）庫數據庫進行比對。由于質譜掃射選用的是負離子模式，所以圖11中的221.0所對應的物質應是丟失一個氫離子的MBP，164.9對應的物質應是丟失一個氫離子的PA。如圖12所示，推測菌株YC-JY1降解DBP的起始代謝途徑為：DBP通過水解反應形成MBP，MBP進一步水解形成PA。

圖11 DBP代謝產物HPLC-MS分析圖

圖12 DBP代謝途徑推測

3 討論

Xanthobactersp.是一類廣泛存在于自然環境中的革蘭氏陰性菌，已發現該屬的菌株具有降解多種污染物的能力。Xanthobactersp.有較多關于降解含鹵素的有機污染物的文章，Hosoda等［12］篩出的菌株XautotrophicusGJ10 和 Kevin McClay等［13］篩出的菌株XautotrophicusENV481都是能夠利用鹵化烴作為唯一的碳源和能源，對其進行脫鹵作用。Petrus等［14］從土壤中分離出Xanthobacter autotrophicusPy2.，可以對汞和甲基汞進行有效地降解。這些都表明，Xanthobactersp.在環境污染物的降解方面起到了重要作用。盡管來自不同環境的微生物降解PAEs的研究有很多，但是至今還沒有關于Xanthobactersp. 降解DBP的文獻。本文關于Xanthobactersp. 降解DBP 的報道，為Xanthobactersp. 降解有機污染物研究提供了參考。

細菌對PAEs的降解已有很多的研究，其中pH和溫度是影響菌株降解能力的重要因素，目前有關Xanthobactersp.降解最適條件已基本清楚。Schneider等［15］提出Xanthobacter autotrophicus.最適生長條件是 pH 6.8-7.2；Padden等［16］也發現，Xanthobacter aminoxidans最適pH 為7.2-7.9，在pH 6.5-8.5 也可以生長，這與上述實驗數據基本一致。蒼白桿菌屬（Ochrobactrumsp.）降解DBP，pH 4.0-10.0 時，DBP的降解率在5%-100%。與之相比，菌株YC-JY1能在更廣泛的pH范圍內降解DBP［17］。也有相關文章表明Xanthobactersp.生長和降解的最適溫度為28℃和32℃［18-19］，與本實驗中菌株YC-JY1最適降解溫度30℃相符合。此外，在以前有關Xanthobactersp.的研究中，也未測過鹽度對其降解DBP的影響，而鹽度也是影響菌株降解能力的一個因素。本研究對Xanthobactersp.的耐鹽特征進行了補充。

關于菌株對DBP的最大耐受濃度現已有很多報道。Herbert等［20］發現鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonassp.）DEP-AD1通過20 d的培養，發現其可以在139 mg/L 的DBP中生長。而菌株YC-JY1在400 mg/L DBP中，3 d就可以看出明顯的生長。金雷等［21］篩出DBP降解菌株，類芽胞桿菌屬（Paenibacillussp.）S-3在5 d內能夠將100 mg/L DBP降解82.7%，而菌株YC-JY1在5 d內可以將100 mg/L DBP完全降解。與之相比，菌株YC-JY1對DBP具有更好的降解能力和耐受能力。

4 結論

本研究從長期受石油污染土壤中篩選出一株可以利用DBP作為唯一碳源的菌株，根據16S rDNA鑒定，確定其屬于黃色桿菌屬（Xanthobactersp.），并命名為YC-JY1。DBP降解的最優條件是30℃，pH 7.0，不添加NaCl；菌株YC-JY1能夠高效降解100 mg/L-400 mg/L DBP，并具有相對廣泛的PAEs底物譜。5 d內可以將100 mg/L DBP完全降解，對于100 mg/L DPeP和100 mg/L DHP可大部分降解；通過HPLC-MS分析，菌株YC-JY1降解DBP的中間代謝產物為MBP和PA，由此推測其起始代謝途徑為DBP水解為MBP，MBP進一步水解為PA。