橡膠樹膠孢炭疽菌NADPH氧化酶功能研究

郭云峰 安邦

（海南大學熱帶農林學院 海南省熱帶生物資源可持續利用重點實驗室，海口 570228）

橡膠樹炭疽病害是海南省橡膠園區主要的真菌病害之一，主要由膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）引起。該病原菌能夠侵染橡膠樹葉片、葉柄及果實，引起橡膠樹嫩梢回枯及重復落葉，推遲開割時間，從而影響膠乳產量［1-2］。目前對于該病害的防治主要依靠噴施化學農藥，雖然短期內效果顯著，但是容易對環境造成污染，也會引起病原菌產生抗藥性。因此，從分子水平上研究膠孢炭疽菌的致病機制，有助于新型農藥的開發。

煙酰胺腺嘌呤二核磷酸（Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）氧化酶（Nox）是一類定位于細胞膜上的特殊蛋白，它們是真核生物細胞內氧化還原信號的關鍵酶，也是細胞內活性氧（Reactive oxygen species，ROS）的主要來源。在動物細胞中，Nox通過控制細胞內ROS水平，參與調控機體免疫反應及一系列生理功能［3］。在植物細胞中，Nox參與調控植物生長發育及生物或非生物脅迫應答反應［4］。近年來，研究者們在真菌中也發現了一系列Nox蛋白，它們在真菌的生長和分化過程中起著重要作用［5］。在構巢曲霉（Aspergillus nidulans）中，NoxA與子實體的形成密切相關［6］。進一步研究表明，NoxA主要通過調控構巢曲霉菌絲尖端ROS的代謝來維持菌絲的頂端優勢［7］。在粗糙脈孢菌（Neurospora crassa）中，Nox1的缺失會導致雌性不育、降低分生孢子的形成、并且降低菌絲生長的速度；而Nox2的缺失會導致接合孢子失去萌發能力［8］。此外，在病原真菌中，Nox也與病原真菌對寄主的致病力有著密切關系。在稻瘟菌中，Nox與附著胞侵入水稻葉片的能力密切相關［9］。在腐生型植物病原菌灰霉菌（Botrytis cinerea）中，Nox與灰霉菌的生長發育以及致病力密切相關［10］。在人體病原菌白色念珠菌（Candida albicans）中，Nox參與調控病原菌的形態轉變及對寄主的致病力［11］。

通過蛋白序列比對發現，在橡膠樹膠孢炭疽菌基因組中存在著3個編碼Nox蛋白的基因，分別命名為CgNoxA、CgNoxB、CgNoxC。此外，在基因組中還存在一個編碼Nox調節蛋白的基因，命名為CgNoxR。至今為止，尚未有關橡膠樹膠孢炭疽菌Nox功能的研究報道。在本研究中，通過構建這4個基因的敲除突變株及對敲除突變株的生理表型的分析，初步闡明了Nox在膠孢炭疽菌中的功能。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 橡膠樹膠孢炭疽菌野生型菌株由本實驗室分離保存，并在前期工作中完成該菌株的基因組測序工作。

1.1.2 實驗試劑 實驗所用基因敲除載體pBS-SUR由本實驗室改造，以pBluescript II KS（+）為骨架，在PstI，EcoRI位點處連入氯嘧磺隆抗性基因（稻瘟菌乙酰乳酸合成酶基因，SUR）。PCR引物合成及DNA測序由華大基因公司完成，DNA聚合酶、DNA Marker及大腸桿菌感受態均購自北京全式金公司，限制性內切酶及T4 DNA連接酶購自Fermentas公司，羧芐青霉素、卡那霉素、氯嘧磺隆均購自Sigma公司，裂解酶（Lysing enzyme）及聚乙二醇（PEG 3350）購自Sigma公司，其它化學試劑采用國產分析純。采用土豆浸膏培養基（PDA）培養基，完全培養基（CM）及麥芽提取物培養基（MEA）培養菌株。采用再生培養基（含1 g/L 酵母浸粉，1 g/L酸水解酪蛋白以及6 mol/L蔗糖）培養真菌原生質體。

1.2 方法

1.2.1 橡膠樹膠孢炭疽菌Nox預測 應用BioEdit軟件，以膠孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides strain Nara gc5的Nox蛋白序列為模板，在本實驗室測序拼接的橡膠樹膠孢炭疽菌基因組數據庫中進行Blast-P，檢索同源序列。

1.2.2 敲除載體的構建 本實驗中采用同源重組原理進行目的基因的敲除，具體策略如圖1所示：以野生型菌株基因組DNA為模板，分別擴增待敲除基因序列的上下游片段，作為同源重組所需的同源臂；經測序分析正確后，將上下游片段分別用對應的限制性內切酶（表1）進行雙酶切，并依次連入敲除載體pBS-SUR的SUR基因的左右兩側，完成敲除載體的構建。之后以敲除載體為模板，利用上游同源臂的正向引物及下游同源臂的反向引物，用高保真酶擴增基因敲除所需的DNA片段，回收備用。

1.2.3 原生質體轉化 橡膠樹膠孢炭疽菌原生質體的制備及轉化參照文獻［12］所述方法進行。將野生型菌株接種到PDA培養基上，28℃培養7 d。然后使用無菌水收集分生孢子，并使用無菌濾膜除去菌絲體。再將孢懸液接種于200 mL液體完全培養基中，使得孢子初始濃度為105個/mL，將孢子在28℃，160 r/min震蕩培養14-16 h。采用無菌濾膜收集菌絲體，并將菌絲體轉移到含10 mg/mL裂解酶的1 mol/L山梨醇緩沖液中，在28℃，100 r/min培養3 h以降解菌絲體細胞壁。然后在冰浴條件下，使用無菌濾膜過濾收集原生質體，在4℃、2 000 ×g條件下離心10 min收集原生質體，并用冰冷的1 mol/L山梨醇緩沖液沖洗2次除去殘余酶液。最后，用山梨醇緩沖液將原生質體濃度調整至108個/mL。在上述制備好的200 μL原生質體中，加入100 μL重組DNA片段，緩慢吸打混勻，于冰上放置20 min。然后在混合物中緩慢加入1 mL含40% PEG的山梨醇緩沖液，并顛倒混勻，于28℃放置20 min。待轉化完成后，在轉化混合物中加入5 mL液體再生培養基，在28℃，100 r/min再生培養4 h。之后在培養物中加入處于熔化狀態、溫度在50℃左右、含1%瓊脂的固體再生培養基，顛倒混勻后平鋪于培養皿中。待培養基凝固后，再在其上平鋪含100 μg/mL氯嘧磺隆的固體再生培養基。培養皿置于28℃培養3-4 d。

圖1 敲除原理圖

1.2.4 敲除突變株的鑒定 本實驗中采用氯嘧磺隆篩選轉化子。待轉化、再生培養后，將陽性轉化子轉接到PDA培養基進行擴大培養，并提取其基因組DNA進行PCR鑒定。為了檢測基因敲除片段是否正確重組到目標基因位點，本實驗中采用兩輪PCR檢測方法鑒定轉化子，具體策略如圖1所示：在重組片段中的上游同源臂的外側及抗性基因SUR序列中設計一對檢測引物；同理，再在下游同源臂的外側及抗性基因SUR序列中設計一對檢測引物；通過PCR擴增檢測重組片段是否正確整合到目標基因的位點。獲得正確的敲除突變株后，通過單孢分離對篩選到的突變株進行分離純化。將檢測正確的突變體菌株接種到PDA培養基上，28℃培養7 d。然后使用無菌水收集分生孢子，使用無菌濾膜除去菌絲體，計算孢子濃度，配置成濃度為103個/mL的孢懸液，并取100 μL均勻涂布在含100 μg/mL氯嘧磺隆的MEA平板上，放置于28℃培養箱中培養。待長出菌落后，提取其基因組DNA進行檢測。

1.2.5 產孢量檢測及孢子形態觀察 將野生型菌株與4種敲除突變株分別接種到PDA培養基上，28℃培養7 d。然后使用無菌水收集分生孢子，并使用無菌濾膜除去菌絲體。然后使用血球計數板于光學顯微鏡下計算孢子濃度，接種于30 mL的液體完全培養基之中，使得孢子初始濃度為103個/mL。將菌株置于28℃，160 r/min震蕩培養3 d之后，統計孢子濃度［9］。取上述重懸于新鮮完全培養基中的孢子懸浮液，滴加在干凈的載玻片上，于28℃、濕潤環境下培養6 h，利用顯微鏡定時觀察孢子形態。

1.2.6 致病力分析 采集生長正常、沒有損傷的嫩綠期的橡膠樹葉片用于致病力分析。如上所述，收集不同菌株的分生孢子，用新鮮完全培養基重懸，制備成濃度為2×105個/mL的孢子懸浮液。之后在葉片上滴加5 μL孢子懸浮液，并將接種后的離體葉片置于光照培養箱中，28℃、濕潤環境下培養5 d，觀察葉片發病情況，統計發病率，記錄葉片病斑直徑。每個處理共包含30片葉片，分為3組。本實驗共重復兩次。

1.2.7 菌絲尖端活性氧代謝檢測 如上所述，收集不同菌株的分生孢子，用新鮮完全培養基重懸，制備成濃度為2×105個/mL的孢子懸浮液備用。將無菌玻璃紙覆于PDA培養基上，并在玻璃紙上滴加孢子懸浮液，于28℃、濕潤環境下培養12 h。之后將玻璃紙及玻璃紙上的菌絲體轉移到載玻片上，并在菌絲體上滴加約50 μL的0.4%硝基藍四氮唑（Nitroblue tetrazolium，NBT）染液。染色10 min后，使用蒸餾水漂洗，于顯微鏡下觀察并記錄。

表1 本實驗所用引物。

2 結果

2.1 橡膠樹膠孢炭疽菌Nox基因信息

通過與基因組進行比對，分別搜索到3個Nox同源蛋白，分別命名為CgNoxA、CgNoxB、CgNoxC。此外，在基因組中檢索到一個編碼Nox調節蛋白（NoxR）的基因，命名為CgNoxR。這4個蛋白及其編碼基因的具體信息如表2所示。

表2 橡膠樹膠孢炭疽菌中Nox基因及其編碼蛋白的信息

2.2 敲除突變株的鑒定

利用同源重組原理，通過原生質體轉化法分別獲得了多個具有氯嘧磺隆抗性的陽性轉化子。利用PCR擴增檢測各轉化子，結果如圖2所示。CgNoxA敲除轉化子成功擴增出約1 393 bp、1 741 bp大小的目標條帶；CgNoxB敲除轉化子成功擴增出約1 885 bp、1 497 bp大小的目標條帶；CgNoxC敲除轉化子成功擴增出約1 666 bp、1 630 bp bp大小的目標條帶；CgNoxR敲除轉化子成功擴增出約1 863 bp、1 593 bp大小的目標條帶。經測序分析，表明擴增的條帶為目標條帶，表明基因敲除片段成功整合到目標基因的位點，敲除突變株構建成功。

進一步通過單孢分離，獲得了4個基因的敲除突變株純合體菌株。將這4個敲除突變株分別命名為ΔCgNoxA、ΔCgNoxB、ΔCgNoxC和ΔCgNoxR。

圖2 敲除突變株的PCR鑒定

2.3 突變株產孢量檢測

在液體培養基中培養3 d后，統計不同菌株培養物中孢子濃度。結果如表3所示，在培養3 d后，野生型菌株培養物中孢子濃度約為21×105個/mL；在4個敲除突變株中，ΔCgNoxA的孢子濃度僅為1.1×105個/mL，遠遠低于野生型菌株；ΔCgNoxB的孢子濃度僅為116×105個/mL，孢子產量提高了約5倍；ΔCgNoxB和ΔCgNoxR的產孢量與野生型菌株相比略有下降，分別為15×105個/mL及8.6×105個/mL。

表3 突變株產孢量檢測結果

2.4 突變株孢子形態及萌發過程觀察

將4個基因的敲除突變株及野生型菌株的孢子進行培養，并對其孢子形態及萌發過程進行觀察。結果（圖3）表明，4種突變株的孢子形態與野生型菌株相比沒有明顯差異，但是ΔCgNoxR突變株的孢子萌發過程明顯異常，其孢子芽管長度明顯短于其它菌株，且芽管形態發生變異。

2.5 突變株致病力分析

將4個基因的敲除突變株與野生型菌株同時接種橡膠樹葉片，結果（圖4-A）發現，在接種3 d后，與野生型菌株相比，ΔCgNoxB的發病率明顯下降，約為25%；ΔCgNoxA和ΔCgNoxR的發病率也有不同程度的下降（圖4-B）。此外，ΔCgNoxB侵染葉片后產生的病斑直徑明顯小于野生型菌株；ΔCgNoxA和ΔCgNoxR產生的病斑直徑出現了一定下降（圖4-C）。

圖3 野生型與4種突變體孢子形態與菌絲差異

2.6 活性氧代謝檢測

為了檢測菌絲尖端活性氧代謝情況，本實驗中采用硝基四氮唑染色法對各菌株進行了檢測。如圖5所示，在染色10 min后，野生型菌株的菌絲尖端產生了密集的甲月替（Formazan）沉淀，說明在野生型菌絲尖端存在著明顯的活性氧代謝。而ΔCgNoxA菌絲尖端幾乎沒有形成沉淀，說明其活性氧代謝出現異常；在ΔCgNoxB和ΔCgNoxR突變株中，活性氧代謝水平與野生型菌株相比也出現一定程度的下降。而ΔCgNoxC中活性氧代謝沒有受到影響。

3 討論

在植物與病原菌互作的過程中，ROS作為一種信號分子起著重要作用。在受到病原菌侵染時，寄主植物通過激活一系列信號通路、調節自身代謝，從而產生大量ROS。一方面，這些ROS能夠作為信號分子激活植物的抗病反應，另一方面，這些ROS能夠直接對病原菌產生氧化損傷［13］。近年來的研究表明，在入侵植物的過程中，病原真菌自身也能夠產生ROS，這些ROS能夠作為信號分子調節病原真菌的生長、發育及致病力［5］。而在真菌中，Nox蛋白就是 ROS 的主要來源之一［7，10］。

在橡膠樹膠孢炭疽菌中，存在3個編碼Nox的基因CgNoxA、CgNoxB及CgNoxC。通過檢測這3個基因敲除突變株的表型發現，CgNoxA與膠孢炭疽菌分生孢子的產生密切相關，該基因的缺失導致病原菌在離體培養條件下孢子生成受到影響；而CgNoxB與病原菌對橡膠樹葉片的致病力密切相關，該基因的缺失突變株對葉片的侵染能力、以及侵染后病斑的擴展能力顯著下降。Nox蛋白主要通過調節ROS的代謝來控制病原真菌的表型［7，10］。

為了檢測CgNox蛋白是否與橡膠樹膠孢炭疽菌的ROS代謝相關，本研究中檢測了這3個突變株菌絲中的ROS代謝情況。結果發現，CgNoxA缺失突變株中ROS代謝受到明顯影響，NBT染色法很難檢測到ROS，說明CgNoxA是橡膠樹膠孢炭疽菌中ROS的主要來源。此外，在橡膠樹膠孢炭疽菌基因組中還發現了一個編碼Nox調節蛋白的基因CgNoxR。該調節蛋白在調控Nox蛋白活性中起著重要作用［14-16］，在橡膠樹膠孢炭疽菌中，敲除該基因會導致分生孢子萌發過程產生異常、致病力下降等現象，說明該調節蛋白對病原菌的正常的生理功能有著重要作用。

圖4 致病力檢測

圖5 不同菌株的菌絲中活性氧代謝情況檢測

4 結論

本研究通過構建橡膠樹膠孢炭疽菌中CgNoxA、CgNoxB、CgNoxC及CgNoxR的缺失突變株，以及對突變株表型的分析發現，Nox蛋白在調節該病原菌的孢子產生、致病力過程中起著重要作用。這4個基因可能通過參與調節真菌細胞內活性氧代謝途徑，調控病原菌的生理功能。