丹參川穹嗪對尿酸腎損傷模型大鼠FOXO3α表達影響

陳洪英 ，王海

（1.成都心血管病醫院腎內科，四川 成都 610000；2.成都中醫藥大學藥學院，四川 成都 610000）

0 引言

原發性高尿酸血癥是嘌呤代謝紊亂以及尿酸過量產生或排泄減少所引起的一種多基因疾病，這種疾病由于高發病率且能導致多器官損傷，其復雜的機制和治療局限性是國際醫學界面臨的一個難題[1]。腎臟是尿酸代謝的主要器官，通過腎臟排泄的大量尿酸晶體直接介導并參與腎損傷的發展。此外，高尿酸血癥可以過度激活腎素-血管緊張素系統和內皮素并導致高血壓，損傷腎小動脈內皮細胞功能并刺激血管平滑肌細胞增殖。這些過程可導致腎小球輸入動脈壁硬化和增厚進而引起繼發性腎小管間質炎癥和纖維化[2]。丹參川穹嗪含有四甲基吡嗪、丹參酮和丹參酸等，能夠改善患者血管微循環并降低患者體內炎性因子含量，對治療糖尿病腎病有一定作用效果[3]。尿酸腎病的發病機制較多但是相關研究很少，本研究通過建立高尿酸血癥誘導的大鼠腎損傷模型，探討丹參川穹嗪干預高尿酸誘導腎損傷的分子機制并為治療尿酸性腎病提供新的思路。

1 材料

1.1 動物

健康雄性Sprague Dawley大鼠，體重為190-210g，購于江蘇南農高科技股份有限公司[證書號SYXK(蘇)2016-0056]。SPF鼠飼料由江蘇省協同醫藥生物工程有限公司提供[貨號：xt007]。

1.2 藥物，試劑和儀器

丹參川穹嗪購于貴州拜特制藥有限公司，每支5mL，4℃冰箱保存備用。別嘌呤醇膠囊0.25 g/片(共10片)(批號15010901)購于黑龍江省奧力達奈德制藥有限公司。腺嘌呤(批號A8626)和羧甲基纖維素鈉(批號21902)購于Sigma-Aldrich公司。大鼠單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)酶聯免疫吸附測定(ELISA)試劑盒(批次No.M1752164)購于深圳欣博盛生物科技有限公司。抗TLR4抗體(批號ab13556)，抗FOXO3α抗體(批號ab12162)和抗NLRP3抗體(批號ab214185)購自于Abcam公司。HiFiScript cDNA第一鏈合成試劑盒(貨號CW2569)購于杭州諾揚生物技術有限公司。KAPA SYBR? FAST qPCR Kit Master Mix (2x)(批號KK4601) 購于上海高創化學科技有限公司。所使用的儀器是HC-3018R高速冷凍離心機；5810R臺式冷凍離心機；JY300C電泳儀和電泳槽，JY-2Y1轉膜儀；ChampGel5000凝膠成像儀；StepOne Plus實時定量PCR儀；MULTISKAN MK3全自動多功能酶標儀。

2 方法

2.1 建模，分組和干預

大鼠自由獲取水和食物并適應環境1周后，將大鼠隨機分為正常對照組(n=6)和造模組(n=30)。正常對照組蒸餾水灌胃10mL/kg每天并喂食正常飲食。將腺嘌呤溶解于0.5%羧甲基纖維素鈉溶液中并通過灌胃給予造模組100mg/kg每天，連續18天。從大鼠眼眶采血，當血尿酸水平高于82.50μmol/L且與正常組相比差異有統計學意義(P＜0.05)時認為大鼠高尿酸血癥模型造模成功。收集籠中模型大鼠的24小時尿液，當發現尿蛋白濃度顯著高于正常組時，表明腎損傷且是尿酸造成的腎損傷。將30只模型大鼠通過隨機數表分為模型組，別嘌呤醇（5mg/kg灌胃）陽性藥物組和低、中、高劑量(10、20、40mg/kg灌胃)丹參川穹嗪組，每組6只，干預持續6周。

2.2 標本收集

6周灌胃后，隨機選取各組大鼠一半，腹腔注射戊巴比妥鈉(40mg/kg)麻醉后通過腹主動脈取血。離心收集血清，收集上清液于-80℃保存，用于ELISA和生化指標檢測。收集血液后處死大鼠并取出腎臟。將腎冷凍并儲存在液氮中用于隨后的RT-PCR和Western blot分析。

2.3 指標檢測

采用RT-PCR檢測腎組織中FOXO3α，TLR4，NLRP3和MCP-1基因轉錄水平，TriZol提取100mg腎組織RNA以進行逆轉錄獲得cDNA。PCR反應液 為10μL包 含SYBR FAST qPCR Kit Master Mix(2×)5μL加 上 游 引 物 (10μmol/L)0.2μL加 下游 引物 (10μmol/L)0.2μL加 cDNA 1μL加不 含 核酸酶的超純水(3.6μL)。反應條件為：95℃預變性5min，95℃變性10s，退火5s，60℃延伸34s，共40個循環。進行溶解曲線分析以鑒定PCR產物的特異性。引物設計和合成見表1。Western blotting檢測腎組織中FOXO3α，TLR4和NLRP3蛋白的表達，將100mg腎組織添加到1mL蛋白質提取試劑中混勻。離心后收集上清液，用二辛可寧酸測定試劑盒測定蛋白質濃度。將樣品蛋白質濃度調整至相同水平，加入樣品緩沖液，并在95℃變性5min之后儲存以備后用。使用8%，10%和12%分離凝膠和5%間隔凝膠進行SDS聚丙烯凝膠電泳。當溴酚藍跑到凝膠的末端時電泳終止。濕膜轉移90min。PVDF膜用5%脫脂奶粉封閉。稀釋一抗并放入PVDF膜在4℃下孵育過夜。將二抗體以1：10000的比例稀釋并與PVDF膜孵育40min?；瘜W發光顯影后掃描蛋白質條帶并分析。ELISA用于檢測血清MCP-1蛋白水平，根據制造商說明進行ELISA。

表1 引物設計

2.4 統計學方法

使用SPSS 22.0統計軟件進行分析，GraphPad Prism7軟件繪圖。數據表示為平均值±標準差()。單因素方差分析用于多組比較。兩組之間使用最小顯著性差異檢驗（LSD）進行比較。P值＜0.05認為具有統計學差異。

3 結果

3.1 腎組織中FOXO3α，TLR4，NLRP3和MCP-1 mRNA轉錄水平

在第6周時與正常組相比，模型組FOXO3α的mRNA轉錄水平顯著下調，TLR4、NLRP3和MCP-1的mRNA水平顯著上調(P＜0.05)。與模型組相比，丹參川穹嗪3組的FOXO3α的mRNA轉錄水平顯著上調，3組丹參川穹嗪組的TLR4、NLRP3和MCP-1的mRNA轉錄水平明顯下調(P＜0.05,圖1)。

3.2 腎組織中FOXO3α，TLR4和NLRP3蛋白水平

第6周與正常組相比，模型組FOXO3α的蛋白表達水平顯著下調，TLR4和NLRP3蛋白表達水平顯著上調。第6周與模型組相比，丹參川穹嗪3組的FOXO3α蛋白質表達水平顯著上調，TLR4和NLRP3蛋白質表達水平顯著下調(P＜0.05，圖2)。

圖1 丹參川穹嗪對尿酸性腎病大鼠FOXO3α，TLR4，NLRP3和MCP-1基因表達的影響

圖2 丹參川穹嗪對尿酸性腎病大鼠FOXO3α，TLR4和NLRP3蛋白表達的影響

圖3 丹參川穹嗪對尿酸性腎病大鼠血清MCP-1蛋白表達的影響

3.3 血清中MCP-1蛋白表達水平

在第6周與正常組相比，模型組在6周時血清MCP-1蛋白表達水平顯著上調(P＜0.05)。與模型組相比，3組丹參川穹嗪組血清MCP-1蛋白表達水平在第6周顯著下調 (P＜0.05，圖3)。

4 討論

丹參川穹嗪可改善改善血管內皮功能和腎臟的微循環灌注狀態，清除炎性細胞因子同時實現腎功能保護[4]。TLR是一種I型跨膜蛋白，是先天性免疫系統的主要模式識別受體。在高尿酸血癥分子水平研究中發現Toll樣受體（TLR）介導的免疫信號通路和冷炎素（cryopyrin）炎癥信號通路能夠被尿酸鹽激活[5]。TLR在哺乳動物中能將細胞外抗原識別信息傳遞到細胞中并導致炎癥反應[6]。TLR和相應配體結合導致一系列蛋白級聯反應，包括激活NF-κB和JUN/FOS從而誘導許多快速反應基因的激活并產生參與炎癥反應的效應分子。TLR4在介導炎癥反應信號轉導中起主導作用，TLR4通過著名的TLR4/NF-κB炎癥通路誘導并激活NF-κB參與腎損傷微炎癥狀態的發展并介導腎間質纖維化的發生和發展[7]。研究表明，在白細胞活化后，尿酸鹽通過先天性免疫系統中的TLR2和TLR4激活炎性因子，然后激活白細胞介素[1]，導致炎癥效應和組織損傷[8]。我們的研究結果表明，丹參川穹嗪有效地下調了TLR4的轉錄和蛋白質表達，丹參川穹嗪可能通過抑制TLR信號通路減輕尿酸性腎病大鼠腎臟炎癥反應，從而減輕腎臟損傷。

冷炎素(cryopyrin)也被稱為NALP3，是編碼細胞內NOD樣受體(NLRs)家族成員，參與炎癥復合體的形成，主要在中性粒細胞，單核巨噬細胞和一些原代免疫細胞中表達[9]。在我們的研究中模型組NLRP3的mRNA和蛋白表達水平顯著高于對照組，提示過表達的NLRP3在高尿酸血癥性腎病大鼠中介導免疫炎性腎組織損傷。腎小管上皮細胞的MCP-1表達水平與腎小球損傷程度相關，腎間質局部產生的MCP-1也參與腎小管間質損傷。MCP-1通過作用于腎小管上皮細胞激活NF-κB并增加IL-6和細胞間粘附分子1的表達[10]。腎臟中的尿酸鹽沉積直接刺激腎組織中MCP-1蛋白表達的增加，并通過激活NF-κB誘導炎性因子激活，引起腎血管炎癥反應和巨噬細胞浸潤并促進腎間質纖維化[11]。在我們的研究中尿酸性腎病模型大鼠血清中MCP-1蛋白顯著高表達，丹參川穹嗪和別嘌呤醇能逆轉模型組大鼠腎臟中NLRP3和血清中MCP-1蛋白的表達，改善腎臟炎癥病變，我們推測NLRP3和MCP-1可能作為治療高尿酸血癥性腎病新的藥物治療靶點。

FOXO3α是叉頭框蛋白家族轉錄因子的成員，最近的研究表明它在抑制炎癥反應中發揮重要作用[12]。FOXO3α也可能通過調節單核巨噬細胞的數量和功能或抑制單核巨噬細胞的過度活化而參與炎癥反應的調節[13]。研究已經報道FOXO3α基因缺失小鼠的脾內發生了炎性細胞浸潤，FOXO3α基因缺陷小鼠與野生型小鼠相比NF-κB活化明顯增強并引起T細胞自發性增殖及慢性炎癥細胞浸潤[14]。FOXO3α也是P13K/Akt信號通路的下游分子，炎癥信號通過磷酸化激活PI3K/Akt從而誘導Akt與核內FOXO3α結合并致其磷酸化，磷酸化的FOXO3α從DNA的結合位點分離出來，并從細胞核進入細胞質，從而降低其轉錄活性并阻斷TLR4信號轉導通路[15]。在病原體激活的抗原呈遞細胞中FOXO3α可抑制TNF-α和IL-6等炎性細胞因子產生[16]。因此，FOXO3α對調節免疫介導的炎癥具有 重要的生物學作用。

我們的研究結果表明，丹參川穹嗪顯著上調大鼠腎組織中FOXO3α的mRNA和蛋白表達，可以抑制免疫炎癥關鍵信號分子TLR4，NLRP3和MCP-1的生物學活性。我們推測丹參川穹嗪能夠改善高尿酸血癥介導的腎臟免疫炎癥損傷。