一株蘋果樹腐爛病病原菌的分離與初步鑒定*

豆雅楠 牛世全 豆建濤 趙 丹鄭豆豆 周 璇 王 彥 孔維寶 朱學(xué)泰

（西北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 甘肅蘭州 730070）

蘋果樹腐爛病是世界范圍內(nèi)危害蘋果樹最為嚴(yán)重的真菌性植物病害之一［1］，在我國(guó)主要蘋果產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生，且危害嚴(yán)重。目前，對(duì)于蘋果樹腐爛病的研究已有一些進(jìn)展：2014年，薛應(yīng)鈺等［2］對(duì)甘肅省12個(gè)縣區(qū)23個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)的74個(gè)蘋果園進(jìn)行了蘋果樹腐爛病的發(fā)生和防治情況調(diào)查，結(jié)果表明在所調(diào)查的4 011株蘋果樹中，總體發(fā)病率為41.09%，慶城、鎮(zhèn)原和莊浪果園的果樹發(fā)病率較高，且鎮(zhèn)原果園的果樹發(fā)病最為嚴(yán)重，病情指數(shù)為42.18；臧睿等［3］研究了分離自陜西的61株蘋果樹腐爛病菌（Cytosporaspp.）的生物學(xué)特性及致病性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，陜西省蘋果樹腐爛病菌具有多樣性、致病性分化現(xiàn)象和復(fù)雜性；王旭麗［4］通過(guò)對(duì)我國(guó)河北、河南、陜西、甘肅等9個(gè)省、23個(gè)市、縣的150個(gè)蘋果樹腐爛病分離株的形態(tài)學(xué)、培養(yǎng)性狀的觀察和對(duì)ITS序列的分析及人工條件下致病性試驗(yàn)，明確了該病在我國(guó)的種類和優(yōu)勢(shì)類群，分析了蘋果樹腐爛病菌的遺傳分化規(guī)模，探討和比較了各病菌的表型差異和不同分離株在非自然條件下的致病性差異；孫廣宇［5］等研究了蘋果樹腐爛病發(fā)生程度與樹體營(yíng)養(yǎng)之間的關(guān)系，以期為蘋果樹腐爛病的防治提供理論指導(dǎo)，結(jié)果表明樹體營(yíng)養(yǎng)水平與蘋果樹腐爛病發(fā)生程度有明顯相關(guān)性。

甘肅省作為黃土高原蘋果生產(chǎn)的優(yōu)勢(shì)產(chǎn)區(qū)，同時(shí)也是北方蘋果生產(chǎn)大省，蘋果產(chǎn)業(yè)已成為甘肅省的區(qū)域特色優(yōu)勢(shì)產(chǎn)業(yè)和名副其實(shí)的農(nóng)民增收致富產(chǎn)業(yè)，發(fā)展?jié)摿薮螅?-7］。但近年來(lái)，隨著產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)的調(diào)整和種植面積的擴(kuò)大，蘋果樹腐爛病在各蘋果產(chǎn)區(qū)普遍發(fā)生，且有不斷蔓延之勢(shì)，已成為威脅我省蘋果產(chǎn)業(yè)安全健康和可持續(xù)發(fā)展的主要制約因素。該病主要發(fā)生在成齡的結(jié)果樹上，危害枝干皮層并引起腐爛癥狀，受侵染皮層產(chǎn)生紅褐色軟腐癥狀同時(shí)散發(fā)酒糟味。

為了明確甘肅省鎮(zhèn)原縣蘋果病區(qū)腐爛病的發(fā)病機(jī)理，采用病原菌分離和離體枝條接種法對(duì)甘肅省鎮(zhèn)原縣產(chǎn)區(qū)的蘋果樹腐爛病致病性進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)合形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定手段對(duì)該病病原菌種類及其分類地位做進(jìn)一步確認(rèn)，以期為進(jìn)一步研究蘋果樹腐爛病的生物防治提供新的手段。

1 材料與方法

1.1 供試材料 2016年4月采自甘肅省鎮(zhèn)原縣蘋果種植園有明顯腐爛癥狀的病枝。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 病原菌的分離與純化 采用組織分離法［8］（圖1）。

圖1 病原菌的分離純化路線圖

1.2.2 致病性檢測(cè) 依據(jù)菌落形態(tài)特征，將初步鑒定的菌株用于回接致病性實(shí)驗(yàn)。采用離體枝條接種法［9］（圖2），將 4℃冰箱中保存的菌株移至PDA活化后，制成菌餅用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖2 病原菌致病性檢測(cè)路線圖

1.2.3 病原菌培養(yǎng)性狀描述和形態(tài)鑒定 將初分離與再分離得到的菌株分別接種在PDA培養(yǎng)基上，在28℃恒溫倒置培養(yǎng)5 d后，觀察菌落形態(tài)特征。待菌絲生長(zhǎng)成熟后，顯微鏡下觀察分生孢子形態(tài)特征，參照相關(guān)資料［10］，進(jìn)行分類學(xué)鑒定。

1.2.4 病原菌分子生物學(xué)鑒定 病原菌基因組DNA提取與rDNA-ITS區(qū)PCR擴(kuò)增，將分離得到的菌株接種在PDB培養(yǎng)基中，28℃振蕩發(fā)酵培養(yǎng)3～4 d。離心沉淀，取菌絲體，加入TE緩沖液，煮沸法提取DNA。用真菌rDNA-ITS通用引物ITS1和ITS4（表1）對(duì)rDNA-ITS區(qū)段進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系（30 μL）：Taq DNA 聚合酶 15 μL，引物各1 μL，ddH2O 9 μL。 PCR 擴(kuò)增程序如表2 所示。

表1 真菌通用引物及序列

表2 PCR擴(kuò)增程序

病原菌rDNA-ITS序列測(cè)序及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建，PCR擴(kuò)增得到的產(chǎn)物送華大基因公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)已知序列進(jìn)行同源性比對(duì)分析，采用MEGA6軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 病害癥狀特征 腐爛病主要危害枝干皮層引起腐爛癥狀，枝條染病后表現(xiàn)為病斑部位隆起，有酒糟味，發(fā)病后期病斑處失水干癟，下陷，之后病斑部位著生許多黑色小點(diǎn)為病菌的分生孢子器。

2.2 病原菌的初步分離和致病性檢測(cè) 對(duì)采自甘肅省鎮(zhèn)原縣蘋果產(chǎn)區(qū)3個(gè)采樣點(diǎn)的病原菌分離結(jié)果顯示：通過(guò)組織分離法分離到的菌株為同一菌株（圖3）；在PDA培養(yǎng)基上目標(biāo)菌株的菌落呈雪花狀，菌背白色或深褐色，氣生菌絲稀少（圖4）。依據(jù)科赫法則采用離體枝條接種法將所分離菌株接種于健康枝條，觀察病斑產(chǎn)生情況，記錄病斑直徑，以只接種空白PDA菌餅且在觀測(cè)期內(nèi)未發(fā)病為對(duì)照，結(jié)果顯示：病原菌在接種10 d后病斑迅速擴(kuò)展，病斑大小超出菌餅邊緣，病斑深褐色潰瘍狀，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，病斑面積不斷擴(kuò)大，直至侵染整個(gè)枝條（圖5）；重新分離枝條病組織部位的致病菌株，分離結(jié)果顯示該菌株重新分離的概率為100%。

圖3 病原菌分離結(jié)果

圖4 病原菌菌落形態(tài)

圖5 菌株P(guān)1離體枝條致病性測(cè)定結(jié)果

2.3 病原菌的鑒定 菌株P(guān)1顯微形態(tài)特征結(jié)果顯示菌落初為乳白色、后期為黃褐色，雪花狀、菌背白色或深褐色，氣生菌絲稀少。子囊孢子單細(xì)胞，無(wú)色，香蕉形，分生孢子單孢，無(wú)色，香蕉形。

通過(guò)對(duì)供試菌株的rDNA-ITS序列分析，其序列長(zhǎng)度為594 bp（圖6），將供試菌株的序列通過(guò)BLAST與GenBank核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中已知序列進(jìn)行同源性比對(duì)，并用MEGA6軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖7），結(jié)果顯示菌株P(guān)1與分離自新疆石河子蘋果樹皮的病原菌黑腐皮殼菌（V.mali）（KT934353）聚于同一分支。綜合顯微形態(tài)特征、菌落形態(tài)以及ITS基因序列分析結(jié)果，初步確認(rèn)菌株P(guān)1為黑腐皮殼菌（V.mali）。

圖6 病原菌的DNA電泳圖

圖7 基于ITS基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

3 討論

黑腐皮殼屬（valsa）屬于子囊菌門，它們大多為死體營(yíng)養(yǎng)物，既能寄生、又能腐生，一般在寄主的葉、枝干、果上形成明顯的病斑，并在發(fā)病部位產(chǎn)生各種顏色的霉?fàn)钗锘蛐『邳c(diǎn)等特征［11］。其所致病害的種類較多，很多是重要的經(jīng)濟(jì)作物病害，可導(dǎo)致多種果樹的腐爛病。已有的研究結(jié)果顯示［9］子囊菌門蘋果黑腐皮殼菌的2個(gè)變種，即V.malivar.mali和V.malivar.pyri.是引起我國(guó)梨和蘋果腐爛病的主要病原菌；張旭業(yè)［12］等研究表明甘肅省蘋果樹腐爛病菌有2個(gè)種，分別為V.mali和Valsa malicola，其中V.mali有2個(gè)變種，分別為V.malivar.mali和V.malivar.pyri.Valsa leucostoma和Valsa cincta引起北美、歐洲的桃樹腐爛病，此外有研究結(jié)果顯示［13］，桃樹腐爛病菌除侵染桃樹外，還可侵染杏、油桐、櫻桃、花椒等。目前，對(duì)蘋果樹腐爛病致病菌的研究顯示，我國(guó)蘋果樹腐爛病的主要致病菌是V.mali［13-14］，與本研究結(jié)果一致。

依據(jù)不同的病害類型，植物病原菌的致病性檢測(cè)方法也因此而不同，而腐爛病致病菌測(cè)定多采用離體枝條接種法［15-16］，近些年也出現(xiàn)一些更為簡(jiǎn)便的驗(yàn)證方法，例如韋潔玲［17］、日本學(xué)者 Abe［18］等研究發(fā)現(xiàn)以嫩梢、完全展開葉作為接種材料，材料本身均一性較好，誤差小，鑒定結(jié)果穩(wěn)定，相比于離體枝條接種燙傷程度、深淺、面積難以保持一致和枝條燙傷時(shí)間長(zhǎng)短、水含量不同等問題，其可作為快速、準(zhǔn)確評(píng)價(jià)蘋果樹腐爛病菌致病性的方法。本實(shí)驗(yàn)結(jié)合改進(jìn)的離體枝條接種法對(duì)所分離到的菌株進(jìn)行二次回接鑒定，以重新分離菌株與原菌株一致為原則，最終得到了甘肅省鎮(zhèn)原縣的1株蘋果樹腐爛病的致病菌株（P1），結(jié)合形態(tài)特性和產(chǎn)孢形態(tài)以及系統(tǒng)進(jìn)化分析綜合得出菌株P(guān)1 為黑腐皮殼菌（V.mali）。

原有的對(duì)蘋果樹腐爛病致病菌的鑒定主要依據(jù)經(jīng)典分類學(xué)方法，由于目前尚無(wú)人對(duì)甘肅省鎮(zhèn)原縣蘋果產(chǎn)區(qū)蘋果樹腐爛病的病原菌種類組成和致病性問題進(jìn)行系統(tǒng)研究且通過(guò)經(jīng)典的分類學(xué)方法對(duì)其鑒定具有一定的局限性和不確定性，而分子手段卻能彌補(bǔ)傳統(tǒng)分類學(xué)方法的不足和缺陷，其中真菌的ITS序列具有極為廣泛的序列多態(tài)性，常用于近緣物種的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析、菌種鑒定和種群遺傳分化研究，成為真菌鑒定的重要手段［19］。

目前針對(duì)蘋果樹腐爛病害已開展了一些生物防治工作，楊燕等［20］利用多羥基雙萘醛（Polyhydroxy dinaphthalde）提取物（WCT）研究了該植物源抗病毒復(fù)制抑制劑對(duì)蘋果樹腐爛病病原菌菌絲的生長(zhǎng)抑制情況，以及對(duì)蘋果樹腐爛的防治效果，結(jié)果表明WCT對(duì)蘋果腐爛病菌具有一定的抑制作用和誘導(dǎo)寄主產(chǎn)生抗性的作用；王衛(wèi)雄等［21］從果園土壤和蘋果樹枝條上分離到2株細(xì)菌，該菌對(duì)蘋果樹腐爛病具有很好的拮抗作用，且離體枝條防效測(cè)定表明生防菌原液防效最高，分別為74.43%和 77.07%；薛應(yīng)鈺等［22］從蘋果樹根際土壤中分離到一株對(duì)蘋果樹腐爛病具有很高抑制率的放線菌，離體枝條防效試驗(yàn)表明，該菌發(fā)酵原液對(duì)蘋果樹腐爛病防效可達(dá)75%以上；張清明等［23］分離到了一株來(lái)自于健康蘋果樹枝條的拮抗放線菌卡伍爾鏈霉菌 （Streptomyces cavourensis）A-2，研究結(jié)果顯示其無(wú)菌發(fā)酵濾液對(duì)蘋果樹腐爛病的抑制率高達(dá)95%以上。

本研究室長(zhǎng)期從事極端環(huán)境資源微生物的相關(guān)研究，該生境下微生物易產(chǎn)生適應(yīng)高鹽、高堿環(huán)境的特殊代謝產(chǎn)物和活性物質(zhì)，形成特殊的生理機(jī)制，具有重要的應(yīng)用價(jià)值。王蓓等［24］從甘肅省河西走廊鹽堿土中分離出較多對(duì)立枯絲核菌有較強(qiáng)生長(zhǎng)抑制的生防放線菌，這些拮抗菌株對(duì)供試病原菌的生物防治有重要的應(yīng)用價(jià)值；耿暉［25］等從河西走廊鹽堿土壤中分離篩選出一株對(duì)黃芪根腐病有強(qiáng)生防功能的放線菌株DA4-4-1，經(jīng)鑒定其為鏈霉菌屬藍(lán)紫鏈霉菌，為黃芪根腐病的田間生物防治提供新的手段。

目前本研究室正從敦煌地區(qū)鹽堿土壤中篩選獲得具有生防功能的芽孢桿菌，以期為蘋果樹腐爛病的生物防治提供新的手段。在植物病害中，70%～80%的病害是由病原真菌的侵染所致且部分病原真菌侵染農(nóng)作物時(shí)可分泌對(duì)人畜及環(huán)境有害的毒素和代謝物，對(duì)農(nóng)產(chǎn)品的安全性及生態(tài)環(huán)境構(gòu)成極大威脅［26］，故本研究結(jié)果為后續(xù)蘋果樹腐爛病的生物防治工作提供了新的手段。