超高效液相色譜法測(cè)定曲匹布通含量

羅雨陽(yáng)，朱躍芳 ，石文松，陳陽(yáng)桔

（湖南省株洲市食品藥品檢驗(yàn)所，湖南 株洲 412000）

曲匹布通為利膽藥，可松弛膽道括約肌，降低膽管內(nèi)壓，促進(jìn)膽汁和胰液的排放，使膽總管膽汁充盈，且有解痙鎮(zhèn)痛及利膽消炎的作用[1－2]。曲匹布通質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于化學(xué)藥品地方標(biāo)準(zhǔn)上升國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)第四冊(cè)[3]，《中國(guó)藥典》暫無收載。現(xiàn)行曲匹布通國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中含量測(cè)定采用容量法[4]，該方法較煩瑣，取樣量大，且制劑輔料嚴(yán)重干擾終點(diǎn)的判斷，專屬性較差。目前，曲匹布通含量的檢測(cè)方法主要有容量法、紫外法[5]和高效液相色譜法[6－13]。本研究中建立了超高效液相色譜（UPLC）DAD檢測(cè)器測(cè)定曲匹布通含量的分析方法[14－15]，經(jīng)方法學(xué)論證，結(jié)合大量樣品（包括國(guó)外原研制劑和國(guó)內(nèi)仿制藥）分析數(shù)據(jù)，證實(shí)方法簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確，能為曲匹布通的質(zhì)量控制提供一定的參考。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1290型超高液相色譜議，配備 DAD檢測(cè)器，Chemistation數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)（美國(guó)安捷倫公司）；KQ5200DE型超聲波清洗器（昆山舒美超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

曲匹布通原料藥（湖南千金湘江藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)分別為 20160504，20160505，20170101）；曲匹布通片（湖南千金湘江藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)分別為150501，160501，161101，171001，規(guī)格為每片 40 mg）；曲匹布通片（日本大原藥品工業(yè)株式會(huì)社，批號(hào)分別為HH88，KF93，規(guī)格為每片 40 mg）；曲匹布通對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)為100439－200301）；甲醇（色譜純，美國(guó)Fisher公司）；冰醋酸、醋酸鈉試劑（分析純，國(guó)藥集團(tuán)）；水為實(shí)驗(yàn)室自制超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Waters Atlantis?T3柱（100 mm ×2.1 mm，3 μm）；流動(dòng)相：0.01 mol／L 醋酸鈉溶液（用冰醋酸調(diào)節(jié)pH 至 3.0）－ 甲醇（40∶60）；流速:0.5 mL ／min；進(jìn)樣量：1 μL；柱溫:35℃；DAD 檢測(cè)器掃描波長(zhǎng)：190～400 nm；檢測(cè)波長(zhǎng):271 nm。

2.2 溶液制備

取曲匹布通片輔料41.9 mg，精密稱定，置50 mL容量瓶中，加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為陰性對(duì)照品溶液。取曲匹布通對(duì)照品12.5 mg，精密稱定，置25 mL容量瓶中，加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液。另取曲匹布通樣品（批號(hào)為170101）25.1 mg，精密稱定，置50 mL容量瓶中，加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：取2.2項(xiàng)下3種溶液分別進(jìn)樣，結(jié)果曲匹布通供試品溶液與對(duì)照品溶液色譜峰保留時(shí)間均為2.07 min，兩者DAD掃描光譜圖一致，且陰性對(duì)照品溶液在相應(yīng)保留時(shí)間處無明顯色譜峰，表明輔料不干擾樣品測(cè)定。色譜圖見圖1。

圖1 超高效液相色譜圖

線性關(guān)系考察：取曲匹布通對(duì)照品25.01 mg，精密稱定，置10 mL容量瓶中，加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻，分別取 0.4，0.8，1.2，2.0，4.0 mL 置 5 個(gè) 10 mL容量瓶中，用流動(dòng)相稀釋成質(zhì)量濃度分別為0.100 04，0.200 08，0.300 12，0.500 20，1.000 40 g ／L 的系列溶液，按擬訂色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖。以曲匹布通的峰面積（Y）對(duì)質(zhì)量濃度（X，g／L）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性方程 Y＝3 267.003 77X＋25.157 508，r＝0.999 92（n＝5）。表明曲匹布通質(zhì)量濃度在0.100 04～1.000 40 g／L范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取曲匹布通原粉（批號(hào)為20160504）及曲匹布通片（批號(hào)為150501），各6份，進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn)，以精密度試驗(yàn)結(jié)果計(jì)算對(duì)照品含量，曲匹布通原粉含量均值為100.70%，RSD為0.5%（n＝6），曲匹布通片含量均值為100.75%，RSD為0.5%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

精密度試驗(yàn)：取同一曲匹布通對(duì)照品溶液，在271 nm波長(zhǎng)處連續(xù)進(jìn)樣5次。結(jié)果的 RSD為0.3%（n＝5），表明儀器精密度較好。

加樣回收試驗(yàn)：取曲匹布通原料（批號(hào)為170101）9份，按湖南千金湘江藥業(yè)股份有限公司處方添加相應(yīng)的空白輔料，配制成曲匹布通低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度的溶液，另取同批號(hào)曲匹布通原料2份，配制成相應(yīng)濃度的對(duì)照品溶液，按外標(biāo)法計(jì)算回收率。結(jié)果見表1。

表1 曲匹布通加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n＝9）

耐用性試驗(yàn)：取同一批（批號(hào)為171001）供試品溶液，分別用色譜柱Waters Atlantis?T3柱（100 mm×2.1 mm，3 μm），Zorbax RRHD Extend－C18柱（50 mm ×2.1 mm，1.8 μm），Agela Venusil MP C18柱 （33 mm × 4.6 mm，3 μm），按擬訂色譜條件進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示，使用不同色譜柱曲匹布通含量測(cè)定結(jié)果基本一致，結(jié)果的 RSD為1.1%（n＝6），表明試驗(yàn)?zāi)陀眯粤己谩?/p>

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一批（批號(hào)為20160505）供試品溶液，按擬訂色譜條件分別在配制后 0，2，4，6，8，10，12，18 h時(shí)進(jìn)樣。結(jié)果顯示，曲匹布通峰面積的 RSD為0.7%（n＝8），表明供試品溶液在18 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4 樣品含量測(cè)定

取曲匹布通供試品約25 mg，精密稱定，置50 mL溶量瓶中，加流動(dòng)相溶解（必要時(shí)超聲）并稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液，精密量取1 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖；另取曲匹布通對(duì)照品適量，同法測(cè)定。按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算，即得。同時(shí)對(duì)3批曲匹布通原粉、6批曲匹布通片進(jìn)行檢測(cè)，其含量測(cè)定結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果（%，n＝9）

3 討論

3.1 色譜條件優(yōu)化

曲匹布通易溶于甲醇，難溶于水，故采用甲醇－水的流動(dòng)相體系，但此體系下曲匹布通主峰有拖尾現(xiàn)象。參考文獻(xiàn)[11]，引入緩沖鹽能改善峰形，醋酸鹽緩沖體系能較好地解決曲匹布通峰拖尾問題，故采用醋酸鈉溶液作為緩沖溶液。考察不同流動(dòng)相pH對(duì)峰型的影響，結(jié)果pH為3.0時(shí)，出峰時(shí)間適宜，峰形較好。同時(shí)，考察了不同流速對(duì)出峰時(shí)間的影響，結(jié)果流速為0.5 mL／min時(shí)，曲匹布通出峰時(shí)間為2.07 min，且無雜質(zhì)峰干擾，故選擇流速0.5 mL／min。考察不同進(jìn)樣量的影響，結(jié)果進(jìn)樣量為1～5 μL時(shí)，曲匹布通峰形均較好，為保護(hù)色譜柱，延長(zhǎng)色譜柱的使用周期，采用1 μL作為進(jìn)樣量。

3.2 最佳檢測(cè)波長(zhǎng)選擇

根據(jù)試驗(yàn)要求，將曲匹布通與流動(dòng)相結(jié)合，用DAD檢測(cè)器進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，考察最佳檢測(cè)波長(zhǎng)，波長(zhǎng)為235 nm時(shí)曲匹布通峰面積響應(yīng)值最大，但考慮存在末端吸收的情況，最終確定曲匹布通檢測(cè)波長(zhǎng)為271 nm。

3.3 對(duì)照品選擇

目前，曲匹布通對(duì)照品為供紫外檢測(cè)法檢查溶出度用的對(duì)照品，用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中的滴定法進(jìn)行測(cè)定，其含量低于湖南千金湘江藥業(yè)股份有限公司提供的原料，故選擇企業(yè)提供的原料（批號(hào)為170201）作為含量測(cè)定的對(duì)照品。