獺兔源金黃色葡萄球菌16S rDNA鑒定與耐藥性分析

張國權，孫樂天，王國艷，王志宇，曹 亮 ，李燕平，任克良

（1.山西省農業科學院畜牧獸醫研究所，山西太原030032；2.太原動物園，山西太原030009）

葡萄球菌是空氣、地面及物體表面等環境中正常存在的細菌，同時，也存在于飼料及飲水中，可在不致病的情況下，寄生在人及畜禽的皮膚、黏膜、腸道、呼吸道及乳腺中[1]。金黃色葡萄球菌是葡萄球菌中致病性最強的菌株，常引起全身化膿性炎癥或致死性膿毒敗血癥。兔是對金黃色葡萄球菌最為敏感的一種動物[2-5]。2017年7月中旬，山西省某獺兔場獺兔發生以呼吸道癥狀為主的疾病，剖解病死兔，從其肺臟、皮膚膿包分離得到疑似優勢致病菌株，經實驗室鑒定，確診為金黃色葡萄球菌。

本研究對分離出的山西獺兔源金黃色葡萄球菌進行了體外敏感藥物試驗，以期對由該病原菌引起的呼吸系統、皮膚化膿等病癥在臨床治療中的藥物選擇上起到一定的指導作用。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 病料來源 其來源于山西省某獺兔養殖場病死獺兔的呼吸系統各器官、皮膚膿包。

1.1.2 培養基及試劑 NA固體營養培養基、麥康凱固體瓊脂培養基、肉湯液體培養基、鮮血瓊脂固體培養基。細菌基因組DNA試劑盒，購自北京天根生化科技有限公司；頭孢氨芐、諾氟沙星、阿米卡星、慶大霉素、鏈霉素、阿莫西林、氧氟沙星、多黏菌素B、卡那霉素、痢特靈、四環素、頭孢克羅、頭孢曲松、頭孢哌酮等14種抗菌藥物，均購自北京天壇藥物生物技術開發公司。

1.1.3 試驗動物 從山西省醫科大學實驗動物中心購得16只健康（SPF）體質量為30 g的小白鼠，進行攻毒試驗。

1.2 試驗方法

1.2.1 病原微生物的分離培養

在無菌實驗室中對病料進行微生物分離培養，分別劃線接種于NA營養瓊脂培養基、麥康凱瓊脂培養基和鮮血瓊脂培養基上，置于37℃恒溫培養箱中培養24～36 h，觀察其生長狀態及菌落形態。

1.2.2 涂片鏡檢 將上述培養物進行純化培養后，在無菌實驗室，用鉑金環挑取純化后的單菌落進行革蘭染色、鏡檢。

1.2.3 動物致病性試驗 在無菌實驗室，用鉑金環挑取純化后的單菌落培養物，接種于肉湯液體培養液中，置于37℃恒溫培養箱，培養24～36 h后，分別接種8只健康試驗小鼠，鼻腔滴入菌懸浮液0.2mL/只。選用8只健康小鼠鼻腔滴入0.2 mL無菌肉湯液體培養液作為陰性對照。

1.2.4 分離菌株16S rDNA基因序列測定 按照細菌基因組DNA提取試劑盒（購自北京天根生化科技有限公司）提取DNA（1.6 mL培養菌液12 000 r/min離心10 min），將提取到的基因組作為16S rDNA基因PCR擴增模板。根據GenBank數據庫查詢，用Primer 6.0設計16S rDNA引物，由金唯智基因科技有限公司合成。27F上游引物：5′-AGAGTTTGATC CTGGCTCAG-3′；533R 下游引物：5′-TTACCGCGG CTGCTGGCAC-3′。

反應體系：超純水25 uL，DNA模板2.0 μL，5×Pfu Buffer 5.0μL，dNTPs 2.0 μL，Pfu polymerase 0.5 μL，Primer 1和 Primer 2各 1 uL。于 95℃預變性 2 min，95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，36 個循環；最后在72℃保溫10 min。通過1%的瓊脂糖凝膠電泳，觀察結果。

1.2.5 藥敏試驗 采用國際通用的K-B紙片法，對獸醫臨床上常見的14種抗菌藥物進行體外敏感藥物篩選試驗。選取的試驗藥物分別為諾氟沙星、鏈霉素、阿莫西林、氧氟沙星、多黏菌素B、卡那霉素、痢特靈、四環素、頭孢氨芐、頭孢克羅、頭孢曲松、頭孢哌酮、慶大霉素、阿米卡星。敏感藥物的判定，參照美國臨床和實驗室標準協會[4]的標準，按照其抑菌圈直徑的大小進行判定。

2 結果與分析

2.1 臨床癥狀及病原微生物的分離培養

由圖1可知，肺部有化膿灶，麥康凱瓊脂培養基上生長緩慢；在NA營養瓊脂固體培養基上生長出淡灰色、圓形、光滑、隆起、邊緣整齊的菌落；在鮮血瓊脂培養基上生長出淡灰色、圓形、光滑、隆起、邊緣整齊且有溶血環的菌落。

2.2 涂片鏡檢

在顯微鏡油鏡下觀察為單個或呈串狀排列的革蘭陽性球菌（圖2）。

2.3 動物致病性試驗

在無菌條件下，剖檢試驗組死亡小鼠，進行微生物分離培養，結果顯示，能夠得到與原分離菌株一致的病原菌。

2.4 16S rDNA基因擴增結果

將分離到的菌株，利用16SrDNA通用引物進行PCR擴增，得到大小約480 bp的目的條帶（圖3）。

2.5 16S rDNA鑒定結果

將擴增產物送至山西恩兆因生物技術有限公司測序，將測序結果（序列未公布）與NCBI上其他葡萄球菌參考株16SrDNA基因比對分析，結果表明，擴增序列與NCBI公布的KM010139.1參考株同源性達100%，證實該分離株為金黃色葡萄球菌。

2.6 藥敏試驗結果

本試驗分離的金黃色葡萄球菌對慶大霉素、鏈霉素、多黏菌素B、卡那霉素、氧氟沙星、諾氟沙星、痢特靈耐藥；對頭孢氨芐、四環素、頭孢克羅中敏;對阿米卡星、阿莫西林、頭孢曲松、頭孢哌酮敏感（表1）。

表1 34株金黃色葡萄球菌藥敏試驗結果

3 討論

本研究確定了山西省該獺兔場因呼吸系統疾病死亡的兔子病因是金黃色葡萄球菌感染，部分有消化道病變，拉水樣糞便。金黃色葡萄球菌作為一類重要的可引起人畜共患的細菌性疾病的病原菌，對養殖業及養殖人員安全具有潛在威脅[4-8]。本試驗檢測了34株獺兔源金黃色葡萄球菌對臨床常用藥物的敏感性，明確了山西省獺兔源金黃色葡萄球菌分離株的耐藥情況，分離的獺兔源金黃色葡萄球菌對鏈霉素、多黏菌素B、痢特靈、諾氟沙星耐藥性較高（97.05%以上），其次為氧氟沙星（94.12%）、卡那霉素（91.18%）和慶大霉素（91.18%）、四環素（8.82%），該結果與王華等[9]報道的兔源金黃色葡萄球菌耐藥情況存在一定差異，表明不同地區的同種動物源金黃色葡萄球菌耐藥情況存在一定差異，這可能與不同地區獺兔的飼養、管理方式及飼料中抗生素添加的種類和用量等因素有關；與王登峰等[10-13]報道的牛源金黃色葡萄球菌耐藥情況相近，表明不同地區的不同種動物源金黃色葡萄球菌的耐藥情況存在相近性。細菌的耐藥機制不是一個獨立的機制，是由不同機制共同協同而成的[14-17]。因其耐藥機制的復雜性，一旦產生耐藥性，將會給獸醫臨床治療帶來巨大困難，同時引發公共衛生安全問題[18-20]。

本試驗為進一步探究細菌耐藥性產生的分子機制研究奠定基礎，同時，為本地區的獺兔金黃色葡萄球菌病的治療提供臨床用藥指導，但并不具有廣泛的通用性和代表性。