奶牛乳房炎中藥注射劑的制備

高 翔，韓克光

（山西農業大學動物科技學院，山西太谷030801）

奶牛乳房炎是由于奶牛乳腺組織在擠奶時受到刺激或者由于環境衛生、飼養管理等環節中受微生物感染后引起的一系列炎癥反應[1-2]，最終導致產奶量下降、乳汁廢棄、病牛被淘汰以及治療費用的增加。奶牛乳房炎由于發病率高且久治難愈，預防及治療困難為奶牛養殖業造成了巨大的經濟損失，全球每年因奶牛乳房炎帶來的經濟損失高達300多億美元。因為相對于歐美發達國家而言，我國奶牛養殖業仍處于較低水平，每年因奶牛乳房炎造成的經濟損失達150億～450億元[3]。

在乳房炎的治療方面，抗生素療法起效快，治愈率高，但長期及大劑量的使用，造成耐藥菌株的增加，牛奶中殘留大量抗生素，給人類帶來嚴重的安全隱患。張咚咚等[4]對奶牛乳房炎的細菌分離及耐藥性分析發現，致病菌對常用抗生素青霉素、頭孢曲松、頭孢噻肟等藥物都產生了不同程度的耐藥性。

與抗生素相比，中草藥具有耐藥性低、體內代謝快、殘留小等優點[5]，并且兼具預防與治療的效果，能夠提高機體免疫力。但是傳統中藥劑型，如散劑、煎劑、灌注劑等，由于用量大、藥效低、不易運輸、保存期短等缺點，在動物臨床應用中局限性大。張玲等[6]選取了6味中藥制備成中藥散劑，治療效果良好，提高了產奶量，但是所需散劑劑量大，不易保存，易受潮變質。王金君等[7]選取了10味中藥制備成煎劑，對患病奶牛進行灌服，治愈率可達80%以上，說明該煎劑對奶牛乳房炎有較好的治療效果，但是在制備中時間長、提取溫度高，容易造成一些對熱敏感的有效成分流失。張振國等[8]選取了7味中藥制備成乳房灌注劑，對患病奶牛進行了4 d的乳區灌注，治愈率高達90%，但是在灌注過程中，由于奶牛乳房的倒置結構，藥物注入乳池后部分藥液流出，乳管易堵塞，導致藥物分布不均，影響治療效果。而中藥注射劑的研制彌補了上述中藥治療的缺陷，打破了中藥固有的給藥模式，其具有起效快、生物利用度高、毒性小、易攜帶儲存等特點。唐靜靜等[9]制備的金英黃歸注射液，薛占永等[10]制備的新型復方蒲公英中藥注射液及周緒正等[11]制備的“乳源康注射液”對奶牛乳房炎的治療均表現出較好的效果。中藥注射劑的制備是將中藥通過煎煮、蒸餾等步驟對其中有效成分進行提取。但提取液雜質較多，需要進一步提純精制，在制備過程中如何減少有效成分的損失，提高其穩定性，是研制中藥注射劑亟需解決的難題。

本試驗通過超聲提取法提取和ZTC1+1澄清劑沉淀吸附法純化制備中藥注射劑，依據國家藥典對注射液進行一系列的質量及安全性檢測，且在符合規定后進一步檢驗其抑菌消炎效果，從而建立奶牛乳房炎中藥注射劑制備方法，為奶牛乳房炎的治療提供新的手段。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

乳香、蒲公英、金銀花、黃芩等藥材購自山西省太谷縣醫藥藥材公司。

1.2 試驗儀器

超聲波清洗器、旋轉蒸發儀、循環水式真空泵，4℃冰箱，高效液相色譜儀。

1.3 處方的選擇

根據奶牛乳房炎的發病機制，以及在查閱大量文獻的基礎上發現，蒲公英具有抑菌抗炎、消腫散結的功效[12]；黃芩具有清熱解毒、抗菌、提高機體免疫力的功效[13]，在對奶牛乳房炎治療和預防時，可與蒲公英作為首選藥物進行配伍組方[14]；金銀花具有消炎、抗菌、抗病毒的功效[15]，能夠有效提高蒲公英的治療效果；乳香具有消炎抗腫，止痛的功效[16]。通過與多位臨床獸醫及老師的研究，選用上述4味中藥材作為制備中藥注射劑的處方。

1.4 復方提取液的制備

與傳統煎煮法相比，超聲提取法對中藥有效成分提取率高、時間短、操作簡單，適用于大多數中藥材[17-18]。按處方稱取中藥材，藥材粉碎后過0.42 mm篩，稱取100 g粉碎后的中藥粉末，添加75%乙醇（10倍量），浸泡過夜，20 kHz超聲處理40 min，雙層紗布過濾，剩下的藥渣再加75%乙醇（8倍量），超聲處理20 min，雙層紗布過濾，合并2次濾液，減壓回收乙醇，生藥質量濃度濃縮為1 g/mL，4℃冷藏備用。

1.5 提取液純化方法的篩選

1.5.1 ZTC1+1澄清劑沉淀吸附法（包括A，B共2個組分） 依說明書及參考文獻配制A，B組分溶液[19]。A組分：稱取A組分粉末2 g，先用少量水調成糊狀，然后加適量純水定容至200 mL，待膨脹24 h后攪拌過濾即得1%黏膠液；B組分：稱取B組分粉末2 g，加入少量1%醋酸溶液，攪拌溶解至糊狀，然后加1%醋酸定容至200 mL，待膨脹24 h后攪拌過濾即得1%黏膠液。取200 mL生藥濃度為1 g/mL的提取液，等分為 4 份，標記為 1，2，3，4 組，水浴加熱至80℃，慢速攪拌的同時分別加入A組分黏膠液4，8，12，16 mL，每隔 30 min 左右攪拌一次，2 h 后，于80℃下按同法對應加入制備好的B組分黏膠液2，4，6，8 mL，保溫 10 min，30 min 后再攪拌一次，靜置6 h后過濾。過濾后沉淀烘干稱質量，濾液進行鞣質、蛋白質、澄清度檢查，調pH值為6.5，進行抑菌試驗。

1.5.2 改良明膠沉淀法 取150 mL生藥濃度為1 g/mL的提取液，等分為 4 份，標記為 5，6，7，8 組，水浴加熱至50℃后一邊快速攪拌，一邊緩慢加入5%的明膠水溶液，觀察，當上清液不出現沉淀時停止加入。靜置30 min，加無水乙醇使乙醇含量為70%，75%，80%，85%，冷藏過夜后過濾，沉淀烘干后稱質量記錄，減壓回收乙醇，濾液進行鞣質、蛋白質、澄清度檢查，然后將生藥濃度調成1 g/mL，調節pH值為6.5，進行抑菌試驗，記錄抑菌圈的直徑。

1.6 質量檢查

1.6.1 澄清度檢查 通過眼睛觀察檢測。取100 mL注射液裝于無色玻璃瓶中，背部襯一塊黑布，底部襯一塊白布用來鑒別有色異物，將藥液與人眼放于同一水平線并相距20 cm左右，豎放、橫放、倒放檢查，每次15 s左右。

1.6.2 pH測定 取3批注射液各20 mL，用pH儀分別測定pH，計算平均值。

1.6.3 鞣質檢查 取3批注射液各1 mL，依次滴加1%蛋清生理鹽水溶液3 mL（現用現配），靜置5 min，觀察是否出現渾濁或沉淀。

1.6.4 樹脂檢查 取3批注射液各5 mL于分液漏斗中，然后加10 mL三氯甲烷輕輕振蕩，取上層的三氯甲烷，放在水浴上加熱至蒸干，蒸干后剩下的固體物質添加2 mL冰醋酸，待其溶解后，放入具塞試管中，加3 mL水混勻后靜置30 min，觀察有無樹脂狀物析出。

1.6.5 蛋白質檢查 取3批注射液各1 mL，分別滴加3滴鞣酸試劑，觀察是否出現渾濁。

1.7 高效液相色譜法

1.7.1 色譜條件 Waters1525高效液相色譜儀，2489紫外可見光檢測器，C18色譜柱（250 nm×4.6 nm，5 μm），流動相為 0.4%磷酸溶液與乙腈，選取322 nm為檢測波長，進樣量20 μL，流速控制在1 mL/min，洗脫時間30 min，柱溫25℃。

1.7.2 對照品與供試品溶液配制 乳香、蒲公英、金銀花和黃芩的主要有效成分分別為11-羰基-β-乙酰乳香酸、咖啡酸、綠原酸與黃芩苷[20-23]。精密稱取11-羰基-β-乙酰乳香酸對照品6 mg，咖啡酸對照品10 mg及黃芩苷對照品18 mg，分別置于100 mL棕色容量瓶中，加甲醇稀釋后定容，備用；稱取綠原酸對照品10 mg，加水溶解，稀釋后定容，備用。分別吸取配制好的4種儲備液各1 mL，置于棕色容量瓶中加水稀釋，定容至刻度后搖勻，即得混合對照品溶液；吸取制備的中藥注射液1 mL，置于10 mL棕色容量瓶中加水稀釋，定容至刻度后搖勻，過濾即得供試品溶液。

1.7.3 精密度試驗 精密吸取配制均勻的混合對照品溶液20 μL，按照1.7.1色譜條件，連續進樣6次，記錄所測量的色譜峰面積。

1.7.4 穩定性試驗 精密吸取中藥注射液供試品溶液 20 μL，按照 1.7.1 色譜條件，分別在 0，4，8，12，24，48 h進樣20 μL，記錄所測量的色譜峰面積。

1.7.5 重復性試驗 分別精密吸取同一批中藥注射液供試品5份，按照1.7.1色譜條件，連續進樣6次，記錄所測量的色譜峰面積。

2 結果與分析

2.1 ZTC1+1澄清劑沉淀吸附法純化結果

從表1可以看出，處理2（A組分加入8 mL，B組分加入4 mL）質量檢查合格，澄清度良好，且對3種病原菌抑菌效果最佳。A，B組分不同的加入量在蛋白質與鞣質的處理上面均合格，但并不是隨著加入量的增加而對雜質的吸附與澄清效果越好，當澄清劑加入量達到飽和后反而達不到更好的絮凝沉積效果。

2.2 改良明膠沉淀法純化結果

從表2可以看出，該方法對鞣質和蛋白質的清除效果較好，檢測結果符合藥典標準，并且澄清度良好，對病原菌的抑菌效果能達到中敏程度以上。

表2 改良明膠沉淀法試驗結果

2.3 澄清度檢查結果

注射劑整體清亮，豎放、橫放、倒放均沒有觀察到微粒，澄清度檢查結果合格。

2.4 pH測定結果

從表3可以看出，3批注射液的pH值之間相差都不超過1，并且pH值在4～9，符合國家藥典標準。

表3 pH測定結果

2.5 鞣質檢查結果

注射液加新鮮配制的1%蛋清生理鹽水溶液靜置等待后，藥液仍然澄清，沒有出現沉淀，檢查結果符合規定。

2.6 樹脂與蛋白質檢查

溶解物加水混勻靜置30 min后，沒有樹脂狀物析出；注射液加入鞣酸后，藥液澄清，檢查結果符合規定。

2.7 高效液相色譜法試驗結果

在精密度試驗中，11-羰基-β-乙酰乳香酸、咖啡酸、綠原酸與黃芩苷的峰面積相對標準偏差分別為0.41%，0.43%，0.39%，0.37%；在穩定性試驗中，各色譜峰面積相對標準偏差分別為0.82%，0.89%，0.77%，0.72%；在重復性試驗中，各色譜峰面積相對標準偏差分別為0.75%，0.79%，0.72%，0.69%。各色譜峰的相對保留時間較穩定，相對標準偏差均小于1%，上述試驗結果表明，在該試驗中，儀器精密度良好，中藥注射液供試品在2 d內較穩定，且該方法重復性較好。

3 討論與結論

中藥注射劑的質量控制不僅是針對單一的某個環節，而是貫穿整個制備過程。澄清度作為評價其穩定性與質量的主要指標，應當符合國家藥典標準。由于中藥注射劑成分復雜，在生產過程中溫度、酸堿度的變化及附加劑的不合理使用，會影響注射劑色澤、產生沉淀；鞣質、蛋白質等如果沒有除盡，不僅會影響澄清度，還會降低藥效，嚴重的會出現過敏反應[24-25]。因此，生產過程中應對制備工藝嚴格要求，尋求最佳配伍，從而提高中藥注射劑的質量。

從提取液純化方法的篩選中來看，ZTC1+1澄清劑沉淀吸附法，通過比較不同的加入量，可以發現各方面均合格，在蛋白質與鞣質處理中沒有太大差別，A組分4%、B組分2%沉淀量略高于其他比例，并且在澄清程度上也好于其他比例。改良明膠沉淀法中，在蛋白質、鞣質處理、澄清程度、抑菌效果上，各方面指標均合格，對金黃色葡萄球菌的抑制方面可達到高度敏感；在處理沉淀方面，加入明膠水溶液處理一段時間后，直接加入乙醇后使明膠變性形成大塊兒沉淀，便于過濾[26]，但是各方面結果略差于ZTC1+1澄清劑沉淀吸附法。

高效液相色譜法是對中藥材進行質量分析的一種常用方法，其通過對中藥材中主要有效成分的分析，能夠全面的反映出中藥材質量優劣及注射劑中有效成分含量[27]。在200～400 nm波長內對各對照品進行掃描可知，11-羰基-β-乙酰乳香酸、咖啡酸、綠原酸與黃芩苷在322 nm波長均有較大吸收；通過比較不同流動相的洗脫效果，選定0.4%磷酸溶液與乙腈為流動相，故最終采用同一色譜條件進行測定。本試驗結果表明，該方法對主要有效成分的分離度較高、重復性好，且時間短、操作簡單，可作為中藥注射劑有效成分的測定方法。

采用超聲提取法和ZTC1+1澄清劑沉淀吸附法制備得到的注射液，經澄清度檢查、pH測定、高效液相色譜法等一系列檢查后，所得試驗結果均符合規定，成功制備了防治奶牛乳房炎的中藥注射劑。