微生物脫除真菌毒素機制研究進展

吳麗櫻，徐一達，王海鳴，孫秀蘭

（1.廣州廣電計量檢測股份有限公司，廣東廣州510656；2.江南大學協同創新中心，江蘇無錫214122）

真菌毒素是由真菌代謝產生的一類有毒天然產物，可在人畜體內蓄積，具有致畸、致癌、腎毒性、肝毒性等危害，對健康造成極大威脅?！罢婢舅亍币辉~首次被使用是在二十世紀六十年代，英國10萬多只火雞由于食用了發霉的花生粉餅而意外死去，當時被稱為“火雞X病”。這種毒素后來被確定為黃曲霉毒素B1（aflatoxins B1，AFB1）。真菌毒素這個詞后來被應用到其他真菌的有毒代謝產物，包括伏馬毒素、玉米赤霉烯醇、T-2毒素、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、展青霉素、赭曲霉毒素等[1]。真菌毒素對糧食、飼料的污染是一個全球性問題，全世界每年約有25%的糧食作物受到污染[2]。因此如何降低真菌毒素污染水平，減少對人畜健康的傷害以及經濟損失，是一個歷久彌新的話題。

目前脫除真菌毒素的方法主要有物理、化學、生物3種。物理法脫除包括物理吸附、微波、輻射、高壓脈沖、擠壓膨化等；化學脫除法包括氨氣熏蒸，臭氧、二氧化氯等強氧化劑降解。物理化學方法條件劇烈，容易影響甚至破壞產品的營養價值及風味。與之相比，生物脫除法具有反應條件溫和、高效、特異性強、環境友好，對原料的風味及營養價值損害較小等優點。部分微生物發酵產物甚至能夠增加營養價值或者改善風味。因此，生物法脫除真菌毒素已成為當前研究熱點，而微生物降解菌株更是具有廣闊的應用前景。本文綜述了當前真菌毒素降解菌株篩選方法及幾種主要真菌毒素的微生物脫除機制，可為相關研究提供參考。

1 真菌毒素降解菌株的篩選

1.1 真菌毒素降解菌株的自然界篩選

真菌毒素降解菌株往往可以在含有毒素的環境中篩選得到。通常在選擇性培養基中添加毒素或者毒素類似物作為唯一碳源來篩選真菌毒素降解菌種。計成等[3]和李俊霞等[4]以香豆素為唯一碳源，分別篩選得到了對黃曲霉毒素B1降解率超過75%和85.7%的菌株。Duvick等[5]從被禾谷鐮刀菌污染的玉米、小麥、青貯飼料中篩選出能夠降解鐮刀菌屬產生的毒素，如伏馬毒素和玉米赤霉烯酮。此外，還有一些能夠降解或者轉化真菌毒素的生物菌株可從農業用地的土壤中[6]或者動物腸道中[7]篩選分離得到。在毒素存在的環境中，微生物往往會分泌一些能夠降解毒素的蛋白酶來保護自身免受真菌毒素傷害，或者這些微生物在對抗真菌毒素產生菌時具有競爭優勢。在消化道中的微生物能幫助動物降解食物中的毒素；在被多環芳烴污染的土壤中也發現了真菌毒素降解菌株，這些微生物產生特定的酶能夠降解污染物，也能脫除與污染物結構相似的真菌毒素[8]。

1.2 真菌毒素降解菌株的誘變篩選

從自然界中如污染的土壤、動物腸道、發霉糧食中篩選得到的野生菌株往往存在遺傳穩定性差、降解酶產量較低、活力不足等問題，通過誘變法篩選出具有高產降解酶能力的菌株，是解決這一問題的有效途徑。

真菌毒素降解菌株的誘變篩選主要可通過物理誘變、化學誘變、生物誘變及復合誘變等方法。常用的物理誘變劑有紫外、X射線、微波輻射、激光等；化學誘變指通過添加疊氮化鈉、亞硝基胍、平陽霉素、甲基磺酸乙酯等誘變劑達到誘變目的[9]；生物誘變劑包括DNA片段、轉座子、質粒DNA、噬菌體等，可引起DNA的重復、缺失、錯配從而發生突變。在真菌毒素降解菌株誘變篩選中，紫外線應用最為廣泛、沿用時間最長且誘變效果顯著。張曉雪[10]通過紫外線照射成功誘變一株黑曲霉，其對AFB1的脫除率較原菌株提高了34.1%。

1.3 真菌毒素降解菌株的基因改造篩選

隨著生物技術科學的迅猛發展，傳統的微生物篩選技術已經不能滿足需求，通過基因定向改造篩選能夠表達特定蛋白的微生物已經成為真菌毒素降解領域的研究熱點。利用微生物基因工程，篩選降解酶基因，并進行鑒定、分離和克隆實現降解酶蛋白的高效表達，并將改造后的菌株或者蛋白酶產物應用于糧食、飼料等脫毒。

劉大嶺等[11]和Liu等[12]從假密環菌的粗酶液中提取出了一種有效降解AFB1的胞內酶，并將編碼該酶的基因序列克隆并在畢赤酵母中成功表達。微生物產物中能發揮毒素降解作用的大都是胞內酶或胞外酶，對粗酶液中獲得毒素降解的活性成分，對編碼該蛋白的基因測序、克隆，轉化到目的載體中表達，從而提高活性物質的產量和質量并進行工業化生產和應用，是未來主要研究方向。這需要應用到分子化學、基因工程等多種技術手段，成本與效率也是亟需解決的問題，因而離實際應用仍有一定的距離。

2 主要真菌毒素微生物降解機制

2.1 黃曲霉毒素（aflatoxins，AF）

黃曲霉毒素是一種由二呋喃環及氧雜萘鄰酮構成基本結構的二呋喃香豆素衍生物。AFB1是其中毒性最強的一種，主要作用的靶器官是肝臟，也可引起膽管上皮增生、肝脂質堆積甚至導致肝癌的發生，此外AFB1還會引起機體免疫抑制[13]。

黃曲霉毒素是一種熒光化合物：黃曲霉毒素B族由于其含有內酯環戊酮結構而發出藍色熒光，而黃曲霉毒素G族含有兩內酯而發綠色熒光。黃曲霉毒素的生物降解主要是通過酶促反應使內酯開環，產物喪失熒光性，毒性降低[14]。黃曲霉毒素及其降解產物結構見圖1。

很多細菌和真菌如指孢霉（Dactylium dendroides）、根酶屬（Rhizopus sp.）、Cornybacterium rubrum等能夠通過還原環戊酮上的C-3酮，將AFB1轉化成黃曲霉醇（aflatoxicol）（如圖1b），且在雛鴨膽管增生試驗中發現，黃曲霉醇比 AFB1的毒性小[15]。Samuel等[16]的研究結果顯示，惡臭假單胞菌能夠將AFB1降解為3種產物，紅外結構鑒定表明AFB1上呋喃環及內酯環均被破壞，通過海拉細胞試驗證明3種降解產物的毒性均小于AFB1。

圖1 黃曲霉毒素及其降解產物Fig.1 Aflatoxin and its degradation products

Liu等[17]從一種食用菌Armilleriella tabescens中提取到胞外酶，該酶可將AFB1轉化為一種致突變毒理活性低的產物，降解產物無熒光，表明該酶引起了二呋喃變化而不是破壞分子的內酯部分。從白腐真菌Pleurotus ostreatus和Peniophora sp.中提取到能降解黃曲霉毒素的胞外酶，而這兩種白腐真菌對降解木質素和多環芳烴也具有活性[18]。研究表明，白腐真菌具有黃曲霉毒素降解能力是由于能產生一類含銅多酚氧化酶（漆酶）[19]。研究還發現，來自另外一種真菌Trametes versicolor也可產生漆酶降解黃曲霉毒素。

一些放線菌中也被發現黃曲霉毒素降解活性，而它們通常也能夠降解污染物。例如，橙色黃桿菌fluoranthenivorans，一株從廢棄煤氣廠附近分離的土壤細菌，能利用多環芳烴熒蒽為唯一碳源，有效地降解AFB1[8]。紅平紅球菌（Rhodococcus erythropolis）也是一種能分解多環芳烴的革蘭氏陽性細菌，它的胞外提取物，可以通過對黃曲霉毒素內酯環的破壞使其喪失熒光性，降解成低毒產物[19]。Lapalikar等[20]闡釋了另一種名為恥垢分歧桿菌（Mycobacterium smegmatis）的放線菌降解黃曲霉毒素B1和G1的機制，該菌產生的還原酶還原C-2和C-6之間的α，β-不飽和雙鍵（如圖1c），隨后毒素自發裂解。

AFB1是一種呋喃香豆素，可以降解其他香豆素和呋喃香豆素的一些細菌也可以降解AFB1。Guan等[7]從農場土壤和動物園動物的糞便中分離出一些細菌，包括芽孢桿菌、腸桿菌、紅球菌和短桿菌，這些能夠利用簡單的植物成分香豆素為唯一碳源的細菌，其大多數菌株也能降解黃曲霉毒素。例如，嗜麥芽寡養單胞菌（Stenotrophomonas maltophilia），一種從貘糞便中分離得到細菌，可以在72 h內降解80%的黃曲霉毒素，同時該菌也能降解多環芳烴[21]。由于并沒有發現黃曲霉毒素代謝產物，因此這種降解的機制尚不清楚。

2.2 赭曲霉毒素A（ochratoxin A，OTA）

OTA是一種異香豆素（結構如圖2a所示），由赭曲霉毒素α（結構如圖2c所示）通過酰胺鍵與L-β-苯基丙氨酸（結構如圖2b所示）相連絡合而成。

圖2 赭曲霉素及其降解產物Fig.2 Ochratoxin and its degradation products

研究已經證實了OTA具有腎毒性、肝毒性、致畸性和致癌性，并妨礙鐵的吸收，而它的降解產物赭曲霉毒素α和苯丙氨酸對機體無負面影響[22]。OTA的產生菌在濕熱的南方一般以赭曲霉菌為主，水分大于16%的糧食和飼料會受到其侵害；而寒冷于燥的北方以青霉菌為主，在0℃左右仍有青霉菌生長，給飼料貯藏帶來極大困難。

土壤中的一些短桿菌，如亞麻短桿菌（Brevibacterium.linens）、表皮短桿菌 （Brevibacterium.epidermidis）、凱氏短桿菌（Brevibacterium.casei）等具有改變芳香族化合物結構的能力，其往往也能夠降解OTA[23]。短桿菌降解OTA的主要機制是由于其能夠產生一種羧肽酶A將酰胺鍵水解，這種水解作用可能是一種羧化作用[24]。

釀酒酵母，紅酵母，隱球菌，Trichosporon mycotoxinivorans可以水解OTA的酰胺鍵產生無毒的苯丙氨酸和赭曲霉毒素α。Trichosporon mycotoxinivorans酵母在降解玉米赤霉烯酮時是通過裂解內酯環的模式脫毒的，而在作用OTA時，它的內酯結構并沒有遭到破壞[25]。Phenylobacterium immobile可利用苯丙氨酸為唯一碳源，通過破壞苯丙氨酸的苯基部分，將毒素轉化為無毒的赭曲霉毒素α和其他三種代謝產物[26]。

2.3 伏馬毒素（fumonisins，FB）

在自然界中產生伏馬菌素的真菌主要是串珠鐮刀菌（Fusarium moniliforme）和多育鐮刀菌（Fusarium proliferatum）。這兩種真菌廣泛存在于各種糧食及其制品中，因此它們產生的伏馬菌素容易污染糧食類農產品，尤其是玉米。即使在干燥溫暖的環境中，串珠鐮刀菌是玉米中出現最頻繁的菌種之一。

伏馬毒素是一類由不同的多氫醇和丙三羧酸組成的結構類似的雙酯化合物，包含一條由20個碳組成的脂肪鏈和14、15號碳鏈上連接的兩個相同酯鍵側鏈[27]。目前約有28種伏馬毒素類似物，根據結構可分為4類，其中以伏馬毒素B1（FB1）分布最廣，毒性最強。目前認為伏馬毒素的毒性作用主要與其抑制鞘脂類物質的合成有關。神經鞘脂類作為真核細胞細胞膜的重要組成成分，對細胞的附著、分化、生長和程序化死亡起關鍵性作用[28]。

Benedetti等[29]和Duvick等[30]已從土壤和玉米芯中分別得到能夠降解伏馬毒素的細菌和真菌。楊朋飛等[31]以FB1為唯一碳源，從污泥樣品中分離到1株高效降解FB1的菌株，該菌在液體無機鹽培養基中對FB1的脫除有良好的效果，可在5 d內可將25 μg的FB1全部降解。這些微生物能夠將伏馬毒素作為唯一碳源，并推測其降解機制主要包含兩步（如圖3所示）：第一步羧酸酯酶去除C-15和C-15三羧酸基團，將FB1轉化為水解伏馬毒素B1（HFB1）；第二步在轉氨酶的作用下將HFB1轉化成2-酮-HFB1。在這個過程中，羧酸酯酶基因（fumd）和氨基轉移酶基因（fumI）和一些包含轉錄調控基因、轉運基因和其他涉及伏馬毒素降解的基因簇參與了毒素降解過程[32]。

2.4 展青霉素（patulin）

展青霉素是一種不飽和雜環內酯，主要由青霉菌產生，是水果采摘后的一種重要真菌毒素污染物，通常出現在水果和果汁中，造成重大的經濟損失并引發一系列安全問題[33]。急性暴露展青霉素可引起惡心和胃炎，慢性暴露展青霉素有神經毒性、免疫毒性、致畸性、致癌性[34]。它能與含巰基化合物如半胱氨酸或谷胱甘肽形成共價加合物，使含巰基的活性位點失效[34]。展青霉素及其降解產物結構見圖4。

盡管展青霉素是一種廣譜抗生素，很多細菌和酵母依然可以降解展青霉素。Moss等[35]研究發現釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）在無氧發酵過程中能夠降解展青霉素，而在有氧的環境中，酵母增殖對展青霉素并沒有降解作用。釀酒酵母可以通過打開展青霉素的吡喃環將其轉化為（E）-ascladiol。因此，將果汁發酵成酒或者醋是一種有效去除展青霉素的方式。Ri－celli等[36]從腐爛的含有較高含量展青霉素的蘋果泥中分離得到一株革蘭氏陽性菌Gluconobacter oxydans，能將展青霉素轉化成（E）-ascladiol，而（E）-ascladiol是展青霉素合成的一種前體，其毒性大約只有展青霉素的25%。

一些酵母如 Pichia ohmeri，isolated from ant hills，Pichia membranifaciens和Sporobolomyces roseus等不僅可以抑制展青霉素產生菌的生長，也同樣可以降解展青霉素[37]。研究表明，酵母Rhodosporidum kratochvilovae降解展青霉素的機制是將其轉化為脫氧酪氨酸（desoxypatulinic acid），該物質沒有半縮醛和內酯結構，無法與巰基反應，淋巴細胞試驗顯示，脫氧酪氨酸毒性較展青霉素小得多[34]。

圖3 伏馬毒素及其降解產物Fig.3 Fumonisins and its degradation products

圖4 展青霉素及其降解產物Fig.4 Patulin and its degradation products

2.5 玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEN）

玉米赤霉烯酮是由禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）、黃色鐮刀菌（Fusarium culmorum）等產生的一類二羥基苯甲酸內酯類真菌毒素，其急性毒性較相對較低，其慢性毒性主要表現為生殖毒性，以及對內分泌系統的影響[38]。由于ZEN與雌性激素雌二醇結構相似，通過被動運輸的方法進入到細胞內，與雌激素受體發生結合，從而導致生物體內的激素不能正常工作。ZEN生物活性的重要特征結構是內酯環和C-4羥基。通常以測定與雌激素受體結合實驗來評估其雌激素活性的，雌激素活性喪失代表脫毒成功（ZEN及其降解產物結構見圖5）。

圖5 玉米赤霉烯酮及其降解產物Fig.5 Zearalenone and its degradation products

真菌脫除ZEN的機制主要包括羥基酮的還原、雙鍵斷裂、羥基化、甲基化、硫化作用、糖基化、環破裂等。根霉、鏈格孢菌等多種微生物能將ZEN中C-6酮轉化成 α-玉米赤霉醇（α-zearalenol）和β-玉米赤霉醇（βzearalenol）產物[39]。雖然 β-玉米赤霉醇（β-zearalenol）的雌激素毒性比ZEN小很多，但是α-玉米赤霉醇被證明其毒性是ZEN的10倍～20倍。

破壞ZEN的C-4羥基可導致雌激素活性損失。例如，Cunninghamella bainieri能將ZEN轉化成2，4-二甲氧基，Rhizopus arrhizus可以將ZEN轉化為玉米赤霉烯酮-4-硫酸鹽，這兩種產物都不具有雌激素活性。Kakeya等[40]對粉紅粘帚霉菌株降解ZEN機制進行了研究，發現主要起作用的是該菌分泌的一種蛋白酶，該酶可將ZEN，α-玉米赤霉烯醇和β-玉米赤霉烯醇降解成無毒產物，并克隆出了編碼該蛋白的基因zhd101，導入該基因片段的大腸埃希氏菌同樣具有將ZEN降解成無毒產物能力。

3 微生物脫除真菌毒素的應用

3.1 在食品中的應用

發酵是一種古老的食品加工和保藏方式，其起源可以追溯到7 000多年前的古代巴比倫。酵母和乳酸菌常被用于發酵糧食、果汁、啤酒等，被認為是一種天然有機的食品深加工方式。在過去的研究中已經證實了可通過乳酸菌發酵玉米來脫除真菌毒素[41]。乳酸菌發酵不僅反應條件溫和，而且可以保持食品的營養，改善風味，在降解真菌毒素的同時不產生有毒代謝產物，這種毒素脫除方式被證明主要是乳酸菌細胞壁的肽聚糖通過疏水結合或共價結合等方式吸附并清除毒素[42]。Oluwafemi等[43]研究了乳酸菌降低受污染的玉米籽粒上AFB1的能力。在玉米籽粒中接種了能產黃曲霉毒素的菌株A.flavus，結果證明，不同種類的乳酸菌對脫除AFB1的能力相差較大。盡管有些食品中的乳酸菌相對豐度較高，但是具有毒素結合能力的卻只有極少部分。因此，可以根據毒素脫除能力篩選出特定功能的乳酸菌作為發酵劑應用于發酵工業。

在釀酒工業中，釀酒酵母也表現出了不同的毒素脫除能力。Caridi等[44]報導了釀酒酵母Saccharomyces sensu stricto在葡萄酒釀造過程中脫除OTA的能力，他從20株釀酒酵母中篩選出了7株具有較強OTA脫除能力的菌株，在25℃條件下發酵90 d，可以將OTA從66%～100%不同程度地進行脫除，且證明了從葡萄酒中脫除OTA是釀酒酵母的細胞壁發揮了作用。隨后，Caridi又探究了具有OTA吸附能力的菌株親本及其后代，結果表明OTA吸附能力是由多基因共同控制[45]。有學者通過透射電子顯微鏡對酵母的細胞壁進行了超微結構分析，發現釀酒酵母的細胞直徑或細胞壁厚度影響其對真菌毒素的清除能力[46]。

3.2 在動物飼料中的應用

真菌毒素在全球飼料和飼料原料中污染嚴重，對養殖業甚至人類健康都帶來巨大威脅。某些微生物具有脫除毒素的功能，將其作為飼料添加劑應用于飼料工業的研究在上世紀20年代就已經開展。He等[47]曾報導了微生物在仔豬無氧環境的胃腸道中可以脫除約50%的霉變玉米飼料中的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON）毒素；1998 年，具有凈化毒素功能的菌株Eubacterium BBSH 797被百奧明公司作為飼料添加劑開始商品化，名為Mycofix plus（BiominR），并在多個國家使用。動物實驗結果顯示，Mycofix產品可以顯著降低DON對奶牛以及T-2毒素對肉雞生長的不利影響，且可以增強奶牛瘤胃的菌群活性[48]。Karlovsky[49]報道了其他一些微生物，如Curtobacterium sp.114-2，Pseudotaphrina kochii，Agrobacterium-Rhizobium E3-39，Nocardioides sp.WSN05-2可以脫除 DON毒素，同樣能夠應用于飼料添加劑，且具有脫毒活性的基因通過基因工程可將其植入作物。

4 展望

利用微生物消減真菌毒素的研究已持續幾十年，其降解機制主要是微生物將真菌毒素作為一種營養物質，對其進行了轉化和吸收，從而達到脫毒的目的。在降解過程中，微生物代謝產生的相關的代謝酶系參與了反應。目前已有相關的商品化產品作為飼料添加劑使用。并且，控制產生脫毒作用的酶的基因，如單端孢霉烯乙酰轉氨酶酶基因（TR I101）[50]、玉米赤霉烯酮內酯水解酶基因（zhd101）[51]已經在植物中被表達，能夠在作物收獲前限制毒素的產生。同時，一些毒素也是一些作物疾病的毒力因子，如鐮刀菌枯萎病，引入抗性基因可以抵御這些疾病。因此，如何識別、純化出相關降解酶，并使微生物高產目的酶將其應用于實際生產中，是目前研究的主要方向，且具有很好的市場前景。當前相關的研究主要集中于篩選、克隆對真菌毒素有專一降解作用的生物活性酶基因，以及采用生物技術培育抗真菌毒素的優良農作物品種。隨著產毒真菌基因組測序的完成和基因組學、蛋白組學和代謝組學等新技術的出現，利用生物技術消減、防控真菌毒素的研究將迎來前所未有的發展機遇。