糖氧剝離對海馬神經元Furin、BDNF表達水平的影響

陳燕 張兆輝 張琦 王翠芳

Furin在神經系統有豐富的表達并參與腦源性神經營養因子(BDNF)、血管生長因子(VEGF)的成熟過程[1]。在BDNF的成熟過程中Furin的切割在調控形成具有生物活性的BDNF過程中起關鍵作用[2]。并且我們的前期研究發現Furin在急性缺血缺氧病理過程中介導了星形細胞BDNF細胞內的分泌成熟過程[3]。BDNF廣泛分布于中樞神經系統，在大腦皮層、海馬等部位含量較豐富，對神經元的存活、分化、生長發育起著重要作用。研究已經發現在很多病理狀態下神經元分泌的BDNF的表達水平發生變化。本實驗進一步觀察在海馬神經元糖氧剝離后不同時間點Furin、BDNF的表達水平變化以明確Fuirn是否介導的BDNF的表達水平變化過程。

1 材料與方法

1.1 材料 新生SD大鼠1～2 d齡，由武漢大學實驗動物中心提供。Furin、BDNF抗體及GFAP抗體(abcam)，多聚賴氨酸(sigma),Neurobasal 培養基、B27及D-Hank,s液(Gibco公司)。

1.2 原代神經元培養 將新生24～48 h的SD乳鼠浸入75%冰浴乙醇消毒，取出全腦，在解剖顯微鏡下在小腦端輕輕撥開大腦皮層露出新月形海馬，去軟腦膜、血管網后將海馬組織剪成小組織塊，靜止2 min后去上清，然后加入0.125%胰蛋白酶消化5 min,胎牛血清終止消化，細胞篩過濾，收集細胞懸液；離心后加種植培養基(90% DMEM-F12+10%FBS)重懸，細胞計數，接種于培養皿；24 h后將種植培養基全量換成維持培養基(97% Neruobasal 1%B27+1% l-谷氨酰胺)，以后每3d維持培養基半量換液。

1.3 OGD模型建立 神經元培養到第7 d，去培養基加不含血清的無糖DMEM,將細胞培養板移入潮濕密閉容器，持續泵入95%N2和5%CO2混合氣體，37恒溫處理3 h，低氧誘導后的海馬神經元在再灌注0，12，24、48、72 h五個時間點收集細胞總蛋白。

1.4 蛋白免疫印跡檢測Furin、BDNF蛋白表達水平 以再灌注0 h為對照組，將已收集的低氧誘導后的海馬神經元總蛋白進行蛋白定量(BAC assay，按試劑盒說明操作)，用12%SDS-PAGE分離目的蛋白Furin、BDNF,以管家蛋白GAPDH校正上樣量；將需檢測蛋白標本上樣，電泳，轉膜，封閉，孵抗體。其中各抗體稀釋度依次為抗Furin抗體，抗 BDNF多克隆抗體(1∶1 000)，二抗(1∶3 000)，內參GAPDH(1∶5 000)；ECL發光試劑發光、顯影、定影，Bio-Rad凝膠成像系統采集圖像；檢測重復3次。

1.5 統計學處理

2 結 果

以氧糖剝離再灌注0 h為基數1，對不同再灌注時間點BDNF、Furin總蛋白的灰度值比值進行標準化比較。從圖1中可見BDFN的表達水平隨著再灌注時間的延長而逐漸下降。在最初12 h的再灌注時間內BNDF的表達水平下降約30%，再灌注24 h下調約50%，48 h下調約70%，72 h下調約70%，與對照組比較有明顯差異(12 h,P=0.04;24 h,P=0.04；48 h，P=0.003；72 h,P=0.001)。從圖2中可見Furin的表達水平隨著再灌注時間的延長而逐漸升高。在最初12 h的再灌注時間內Furin的表達水平上調約1.3倍,與對照組比較無明顯差異(12 h,P=0.08)，再灌注24 h上調約2.1倍，再灌注48 h上調約2.5倍，再灌注72 h上調約3.14倍，與對照組比較有明顯差異(24 h,P=0.005;48 h,P=0.004；72 h,P=0.004)。

圖1 OGD誘導3h再灌注0,12,24,48,72 h五個時間點BDNF蛋白表達水平變化 隨著再灌注時間延長BDNF表達水平逐漸下降(與對照組再灌注注不同時間點比較,*P<0.05,**P<0.01)

圖2 OGD誘導3 h再灌注0,12,24,48,72 h五個時間點Furin蛋白的表達水平變化 隨著再灌注時間延長Furin表達逐漸上調(再灌注12h與對照組比較無明顯差異,P>0.05;再灌注24,48,72 h與對照組比較有明顯差異,P<0.01)

3 討 論

Furin是原蛋白轉化酶家族成員之一，其切割底物廣泛。研究表明Furin是BDNF細胞內分泌通路上的關鍵性切割酶。BDNF前體蛋白經Fuirn的切割后形成具有生物活性成熟的BDNF。并且研究表明神經營養因子蛋白前體與成熟的神經因子具有絕然相反的生物學效應,即蛋白前體誘導神經元死亡，而成熟的神經營養因子促進神經元生存，參與突觸可塑性調節。由此可見Furin在決定神經營養因子生物效應中起關鍵性作用。來源于癌細胞的研究結果表明Furin在低氧條件下表達水平上調。

BDNF最初以pro-BDNF的形態在內質網內合成，pro-BDNF在細胞內通過Furin切割后形成成熟的mBDNF，在病理狀態下BDNF的表達水平發生變化，即在癲癇模型中發現BDNF表達水平上調，并且發現原蛋白轉化酶PC1介導了BDNF的表達水平上調過程[4]；在神經退行性疾病中如AD患者中皮質和海馬分泌的BDNF表達水平下調，BDNFmRNA表達水平下調[5]；在精神心理性疾病如抑郁海馬分泌的BDNF的表達水平也是下調[6]。在各種病理狀態下BDNF表達水平變化的細胞內機制不同，并且大多數情況下其具體的細胞內分泌通路調控并不十分清楚。另外，在不同的細胞類型中BDNF的細胞內調節通路可能也不一樣。

對缺血缺氧這一病理狀態下我們的前期研究發現Furin介導了OGD誘導激活的星形細胞的BDNF表達水平的上調過程，這一過程可能參與急性腦缺血時星形細胞的內源性神經保護機制[3]。為進一步明確在缺血缺氧的神經元內是否同樣Furin也參與的BDNF的表達水平變化過程。本研究利用OGD誘導模型模擬急性腦缺血時海馬神經元觀察其細胞內BDNF的表達水平變化。在OGD誘導再灌注后海馬神經元BDNF的表達水平隨再灌注時間延長呈逐漸下調而Furin的表達呈逐漸上調。從初步研究結果分析Furin沒有參與OGD時海馬神經元內BDNF的表達水平變化過程。其原因可能在于原蛋白酶家族其他成員參與了這一條調控過程。原蛋白轉化酶家族成員共有7個，分別為Furin,PACE4,PC5/6,PC1/PC3,PC4,PACE4,LPC/PC7，其切割底物存在交叉。另外，研究發現在坐骨神經損傷時PC1,PC5,Furin和PC7均參與雪旺氏細胞的BDNF表達水平上調過程[7]。在后續的研究中我們將進一步研究海馬神經元內的BDNF的細胞內分泌過程的酶切調節機制。