基于ISSR標(biāo)記分析浙江省櫻花種質(zhì)資源的遺傳多樣性

蔣冬月，沈 鑫，吳 帆，李因剛，石從廣，楊少宗，柳新紅

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基于ISSR標(biāo)記分析浙江省櫻花種質(zhì)資源的遺傳多樣性

蔣冬月1,2，沈 鑫1，吳 帆1，李因剛1，石從廣1，楊少宗1，柳新紅1

（1. 浙江省林業(yè)科學(xué)研究院，浙江 杭州 310023；2. 中國科學(xué)院 植物研究所，北京 100093）

為探究浙江省櫻花種質(zhì)資源的親緣關(guān)系和遺傳多樣性，運(yùn)用ISSR分子標(biāo)記從100條引物中篩選出17條多態(tài)性好的引物對95份櫻花種質(zhì)資源進(jìn)行分析。結(jié)果表明，17條引物共擴(kuò)增出110條清晰條帶，其中101條具有多態(tài)性，平均多態(tài)性條帶比率為91.78%。95份資源間的遺傳相似系數(shù)為0.38 ~ 0.90，平均0.61；遺傳距離為0.10 ~ 1.38，平均0.50。根據(jù)UPGMA聚類分析，在遺傳相似系數(shù)為0.577 5時(shí)，95份種質(zhì)資源可分為四大類，分別包含了23份、42份、25份和5份材料。研究結(jié)果表明浙江省櫻花種質(zhì)資源具有較為豐富的遺傳多樣性。

櫻花；種質(zhì)資源；ISSR；遺傳多樣性；浙江

櫻花是薔薇科Rosaceae李亞科Prunoideae櫻屬典型櫻亞屬植物Subg.的泛稱。全世界約150種，分布于亞洲、歐洲、北美洲等北半球溫和地帶，我國有38個(gè)種，8個(gè)變種；其中，浙江省有10個(gè)種，包括浙閩櫻桃，迎春櫻桃，尾葉櫻桃，大葉早櫻，山櫻花，華中櫻桃等[1-3]。櫻花是浙江省早春開花植物之一，種質(zhì)資源豐富，分布范圍廣，形態(tài)變異大，花色豐富。花色有白色、粉色、玫紅色、黃綠色及各種漸變色和交叉色，花期一般在2－5月，少數(shù)11月至翌年1月；果色多為紅色、紫紅色、深紅色至黑色，果期為4－6月，少數(shù)10月[4]。櫻花既有高大挺拔的喬木，又有低矮稠密的灌木，其花朵數(shù)量多，獨(dú)樹成景，成片種植時(shí)花海極為震撼。由于櫻花種質(zhì)資源分布廣泛，變異豐富，種間或種內(nèi)的自然雜交頻頻發(fā)生，這給野生櫻花的分類鑒定工作帶來了很大的困難；且櫻花在各地同名異物或同物異名的現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生，因此，僅僅依靠形態(tài)特征的鑒定已不能滿足櫻花資源的分類和選育。分子標(biāo)記作為一種以核酸多態(tài)性為基礎(chǔ)的遺傳標(biāo)記，因其不受組織類別、發(fā)育時(shí)期、環(huán)境條件等干擾，具有數(shù)量極多、多態(tài)性高等優(yōu)點(diǎn)，被證實(shí)是評(píng)價(jià)種屬間親緣關(guān)系和遺傳多樣性的理想標(biāo)記[5-7]。ISSR（Inter-simple Sequence Repeat）是建立在SSR（Simple Sequence Repeat）基礎(chǔ)上的一種新型的分子標(biāo)記技術(shù)，具有操作簡單、成本低、多態(tài)性高和重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)[8]，已廣泛應(yīng)用于香茅屬[9]，鳶尾屬[10]，風(fēng)信子[11]，桃[12]等植物的遺傳多樣性和親緣關(guān)系研究。本研究以浙江省野生櫻花資源為試驗(yàn)材料，利用ISSR標(biāo)記從分子水平研究野生資源的親緣關(guān)系和遺傳多樣性，為野生櫻花資源的分類、保護(hù)和利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

2016年5－6月，從浙江省的14個(gè)縣（區(qū)、市）共采集到95份櫻花野生資源（表1），隸屬6種2變種，包括迎春櫻桃，浙閩櫻桃，大葉早櫻，山櫻花，毛葉山櫻花.var.，華中櫻桃，毛萼華中櫻.var.和尾葉櫻桃。每份資源均采集新鮮、無病害的幼嫩葉片作為提取基因組DNA的供試材料，放置于裝有硅膠的自封袋中密封保存至完全干燥。

表1 櫻花種質(zhì)資源及采集地點(diǎn)

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DNA提取 利用植物基因組DNA提取試劑盒（DP3112，Bioteke，北京）提取95份供試材料的基因組DNA，提取前利用預(yù)冷的緩沖液[13]（0.25 M NaCl，0.2 M Tris-HCl pH 8.0，50 mM EDTA，2% PVP，1%巰基乙醇）對樣品進(jìn)行預(yù)處理，以去除大量的多糖、色素等雜質(zhì)。利用1%的瓊脂糖凝膠電泳法檢測DNA質(zhì)量，用Nanodrop超微量分光光度計(jì)（NanoDrop 2 000，Thermo Scientific）測定DNA濃度，并將其稀釋到50 ng·μL-1。

1.2.2 ISSR-PCR反應(yīng) 經(jīng)過預(yù)實(shí)驗(yàn)確定PCR優(yōu)化體系為20 μL反應(yīng)液，包括2×Taq PCR Master Mix（TSINGKE，北京）10 μL，10 μmol·L-1ISSR-primer 0.6 μL，模板DNA 1.0 μL，ddH2O 8.4 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，47.10 ~ 59.50℃復(fù)性30 s（見表2），72℃延伸90 s，共35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸7 min，于4℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠中150 V電泳30 min，然后置于自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)（ChemiDoc XRS+，Bio-Rad）中拍照、記錄。ISSR引物來源于美國哥倫比亞大學(xué)（UBC）公布的ISSR通用引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用人工計(jì)數(shù)法對電泳結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，同一引物擴(kuò)增出的相同條帶記為1，無相同條帶記為0，構(gòu)建0，1數(shù)據(jù)矩陣[14]。根據(jù)0，1數(shù)據(jù)矩陣，利用Ntsys 2.1軟件計(jì)算各樣品間的遺傳相似系數(shù)（Coefficient），并采用UPGMA法進(jìn)行聚類[15]。

2 結(jié)果與分析

2.1 ISSR標(biāo)記多態(tài)性分析

從100條ISSR通用引物中共篩選出17條擴(kuò)增條帶清晰、穩(wěn)定、重復(fù)性好的多態(tài)性引物，見表2、圖1。利用這17條ISSR引物分別對95份櫻花材料的基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，共獲得110條清晰的條帶，長度介于250 ~ 1 200 bp之間，其中多態(tài)性條帶為101條。不同ISSR引物擴(kuò)增的多態(tài)性條帶數(shù)介于4 ~ 8條，平均每個(gè)引物擴(kuò)增5.94條多態(tài)性條帶，平均多態(tài)性條帶比率為91.78%。這些均表明17條ISSR引物對野生櫻花基因組DNA擴(kuò)增的多態(tài)性較高，說明分布于浙江省的櫻花種質(zhì)資源具有豐富的遺傳多樣性。

表2 ISSR引物退火溫度及擴(kuò)增結(jié)果

注：Y = (C,T)；R= ( A,G)。

圖1 UBC813引物對部分櫻花基因組DNA的擴(kuò)增圖譜

Figure 1 Gel diagram of genomic DNA ofspp. amplified with primer UBC813

2.2 櫻花種質(zhì)資源遺傳多樣性和聚類分析

95份野生櫻花資源的遺傳相似系數(shù)范圍為0.38 ~ 0.90，平均0.61；根據(jù)遺傳相似系數(shù)對95份櫻花種質(zhì)資源進(jìn)行聚類分析，在遺傳相似系數(shù)為0.577 5時(shí)，95份野生櫻花分為四大類（圖2）。A類群共23份材料，均為華中櫻桃，其中2個(gè)毛萼華中櫻桃在一起；包括3份資源來自金華市，4份資源來自麗水市，16份來自溫州市。

B類群共42份材料，當(dāng)遺傳相似系數(shù)為0.595時(shí)，將B類群又分為3小類。B1類群有1份材料來自麗水景寧縣的華中櫻桃。B2類群有24份材料，其中6份迎春櫻聚為一類，18份尾葉櫻桃聚為一類。B3類群有17份材料，包括12份迎春櫻，3份華中櫻桃，2份大葉早櫻。

C類群共25份材料，當(dāng)遺傳相似系數(shù)為0.609時(shí)，將C類群又分為2小類。C1類群17份材料，主要為山櫻花類，包括9份毛葉山櫻花，6份山櫻花，1份迎春櫻，1份華中櫻桃，其中山櫻花和毛葉山櫻花聚為1類。C2類群有8份材料，包括4份尾葉櫻桃，2份毛葉山櫻花和2份浙閩櫻桃。

D類群共5份材料，均為大葉早櫻，其中3份來自寧波市，1份來自臺(tái)州市，1份來自金華市。

3 結(jié)論與討論

分子標(biāo)記技術(shù)是繼形態(tài)標(biāo)記、細(xì)胞標(biāo)記以及生化標(biāo)記之后發(fā)展起來的直接反應(yīng)遺傳多樣性的一種遺傳標(biāo)記，可以高效、穩(wěn)定、準(zhǔn)確地鑒定植物材料，評(píng)價(jià)種屬間親緣關(guān)系和遺傳多樣性，已在牡丹[16]，月季花[17]，風(fēng)信子[11]，杜鵑spp.[18]等花卉中廣泛應(yīng)用。在櫻花種質(zhì)資源的研究上，Badenes等[19]、曹東偉等[20]利用RFLP標(biāo)記得出不同櫻桃的親緣關(guān)系；Gerlach等[21]、周春玲等[22]、Hormaza[23]成功利用RAPD技術(shù)對櫻花進(jìn)行親緣關(guān)系鑒定和品種分類；Antonius等[24]、Kato等[25]、商韜等[26]通過SSR標(biāo)記研究櫻花資源的遺傳多樣性。本研究中所用引物平均多態(tài)性條帶比率為91.78%，說明這17條ISSR引物能夠較好的將95份供試材料分開，表現(xiàn)出較高的鑒別效率。這與下列研究結(jié)果一致，宋常美等[27]利用21條ISSR引物對64份中國櫻桃資源多樣性進(jìn)行分析，得到引物的多態(tài)性比例為87.28%；艾呈祥等[28]對34份櫻桃資源進(jìn)行ISSR分析，得到多態(tài)性比率為95.97%；Shahi等[29]通過ISSR對伊朗的野生櫻花資源多樣性研究，得出其多態(tài)性比率均大于81.80%；這些研究均證明ISSR標(biāo)記可以將櫻花種質(zhì)資源區(qū)分開，可作為資源鑒定的有效手段。95份櫻花種質(zhì)資源基于遺傳相似系數(shù)的UPGMA聚類分析（圖2）表明，遺傳背景相近的櫻花資源其彼此間遺傳相似系數(shù)較大，遺傳距離較小，具有較近的親緣關(guān)系。A類群為華中櫻類群，其中毛萼華中櫻和華中櫻桃聚在一起，說明作為華中櫻桃變種，其與原種親緣關(guān)系較近，原種中與YZ16號(hào)華中櫻桃的親緣關(guān)系最近，這符合原種與變種的變異原則。在C類群中，山櫻花和其變種毛葉山櫻花也聚在了一起，形成C1類群；毛葉山櫻花、尾葉櫻桃和浙閩櫻桃聚為C2類群。同時(shí)，調(diào)查時(shí)發(fā)現(xiàn)浙閩櫻桃的葉片和花部形態(tài)特征與毛葉山櫻花、尾葉櫻的有一定的相似性，處于中間過渡類型，因此，YZ82和YZ85可能不是浙閩櫻桃，而是尾葉櫻桃和毛葉山櫻花的雜交后代，這有待進(jìn)一步深入研究。D類群為大葉早櫻類群，YZ30和YZ35號(hào)大葉早櫻沒有聚到D類群里，而是聚到了B3類群里；這2份資源雖然形態(tài)特征上接近大葉早櫻，但其與D類群中大葉早櫻的親緣關(guān)系相對較遠(yuǎn)，這可能是繁殖過程中部分單株發(fā)生了遺傳變異，從而形成一些獨(dú)特的遺傳組成[30]。

Figure 2 UPGMA dendrogram ofspp. based on genetic similarity coefficients

綜上所述，本研究通過ISSR標(biāo)記的方法，篩選出17條多態(tài)性好的引物，在分子水平揭示了所收集到的浙江省野生櫻花種質(zhì)資源具有豐富的遺傳多樣性；并基于遺傳相似系數(shù)將95份種質(zhì)資源分為華中櫻類群、大葉早櫻類群等四大類。本研究證明了ISSR分子標(biāo)記是分析櫻花種質(zhì)資源遺傳多樣性十分有效的方法，通過其遺傳多樣性和親緣關(guān)系的研究可為今后浙江省野生櫻花資源的保護(hù)和利用提供理論依據(jù)，為后期新品種選育提供花色艷、花量大、抗逆性強(qiáng)的親本材料。

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Genetic Diversities ofspp. from Zhejiang Province Based on ISSR Markers

JIANG Dong-yue1,2，SHEN Xin1，WU Fan1，LI Yin-gang1，SHI Cong-guang1，YANG Shao-zong1，LIU Xin-hong1

（1. Zhejiang Academy of Forestry, Hangzhou 310023, China; 2. Institute of Botany, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100093, China）

Collections of 95 germplasm resources ofspp. were carried out in May and June of 2016 from 14 counties of Zhejiang province. Experiments were implemented for their genetic diversities using 17 ISSR (inter simple sequence repeat) markers from 100 ones. The results showed that 110 bands were amplified by 17 primers, in which 101 bands were polymorphic with average percentage of ISSR polymorphism of 91.78 %. The genetic similarity coefficients of tested resources ranged from 0.38 to 0.90, with an average of 0.61. The genetic distances ranged from 0.10 to 1.38, with an average of 0.5. UPGMA (unweighted pair-group method with arithmetic means) analysis demonstrated that 95 germplasm resources could be divided into four categories when genetic similarity coefficient was 0.5775. The results indicated that there were rich genetic diversities inspp.from Zhejiang.

spp.; germplasm resources; ISSR; genetic diversity

10.3969/j.issn.1001-3776.2018.04.001

S685.99

A

1001-3776（2018）04-0001-07

2017-10-29；

2018-03-26

浙江省櫻亞屬遺傳多樣性研究（2017F30017）；國產(chǎn)櫻花新品系無性快繁技術(shù)體系研發(fā)（2016F50024）；浙江省十三五林木新品種選育項(xiàng)目（2016C02056-12）

蔣冬月，助理研究員，從事園林植物應(yīng)用研究；E-mail：jdyzjforestry@163.com。

柳新紅，研究員，從事林木育種研究；E-mail：sliuxh@163.com。