松材線蟲果膠酶基因Bxpel1的克隆及其生物信息學分析

邱秀文，周桂香，王慧娟，楊麗麗

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松材線蟲果膠酶基因1的克隆及其生物信息學分析

邱秀文1,2,3，周桂香1,2,3，王慧娟3，楊麗麗3

（1. 九江學院 鄱陽湖生態(tài)經(jīng)濟研究中心，江西 九江 332005；2. 九江學院 九江市流域管理與生態(tài)保護重點實驗室，江西 九江 332005；3. 九江學院 化學與環(huán)境工程學院，江西 九江 332005）

以松材線蟲轉錄本為模板，通過RT-PCR技術克隆果膠酶1基因。結果表明，松材線蟲果膠酶1基因序列全長為795 bp，GC含量為50.44%，編碼252個氨基酸。通過Blast比對克隆的1基因與已知序列（Gen-Bank ID：AB232908.1）的同源性達到98%。系統(tǒng)進化分析表明，1基因編碼產(chǎn)物的氨基酸序列與擬松材線蟲，燕麥真滑刃線蟲的1蛋白序列具有高度同源性。1基因編碼的產(chǎn)物的0 ~ 25序列有可能是跨膜結構域，而其他序列均位于膜外，其二級結構主要是以無規(guī)則卷曲和β-折疊為主，信號肽的剪切位點位于第17至第18位氨基酸之間，主要在細胞外發(fā)揮生物學作用。1基因的克隆及其生物信息學分析對進一步研究1基因在松材線蟲致病過程中的功能具有重要意義。

松材線蟲；1基因；克隆；生物信息學

松材線蟲病（Pine Wilt Disease）是由松材線蟲引起松屬植物死亡的一種世界性森林病害[1-3]。果膠酶基因是松材線蟲的重要致病因子，有研究表明，松材線蟲入侵松樹時會分泌大量果膠酶來破壞松屬植物細胞壁進而侵入寄主細胞[4-5]。然而，目前關于果膠酶基因在松材線蟲致病過程中的功能還不清楚。果膠由雜多糖和半乳糖醛酸構成，是植物細胞壁的主要成分之一。寄生生物在入侵植物的過程中會大量分泌果膠酶[6]，導致植物細胞壁破壞，從而有利于其成功入侵和定殖寄主植物[7]。動物果膠酶基因（1）最早是在土豆胞囊線蟲中被發(fā)現(xiàn)[8]。隨后，越來越多報道顯示許多植物病原性線蟲均有1，如大豆胞囊線蟲[9]和根結線蟲spp.[10]等。目前關于1在松材線蟲致病過程中的功能還不清楚，有關該基因在松材線蟲致病形成的遺傳進化機理也尚不明確。

生物信息學（Bioinformatics）是由結合統(tǒng)計學、數(shù)學、計算機與生物醫(yī)學多學科的一門新興學科，為功能基因的發(fā)現(xiàn)、基因表達及表達產(chǎn)物的功能研究提供了新思路。利用生物信息學與試驗技術相結合研究基因結構及其編碼產(chǎn)物的組織結構和信息結構越來越普遍[11]。本研究利用分子實驗技術克隆了松材線蟲果膠酶基因（1），并借助生物信息學相關軟件預測和分析了其編碼產(chǎn)物的理化性質、蛋白質二級和三級結構、序列特征及相關生物學功能，研究結果有助于從分子水平上理解果膠酶基因1的結構和功能，為進一步研究松材線蟲果膠酶基因在松材線蟲致病過程中的功能及其遺傳進化機理奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

供試松材線蟲選用九江學院植物基因資源重點實驗室分離保存的蟲株JJU-BLD，該蟲株于2015年8月從江西省九江市星子縣白鹿洞書院一株病死黑松（胸徑45 cm）上分離得到，將松材線蟲接種至灰葡萄孢上，置于25℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，保存于4℃冰箱備用。

1.2 松材線蟲總RNA提取

松材線蟲總RNA采用Trizol細胞裂解液按常規(guī)方法（酚-氯仿）進行抽提，然后將抽提物溶解于適量DEPC（Diethyl pyrocarbonate）水中，取少量總RNA進行濃度及OD260/OD280比值測定，把合格的總RNA置于－80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 引物設計與合成

根據(jù)已公布的松材線蟲1基因的序列（GenBank登錄號為AB232909.1），利用分子生物學軟件Primer Premier 5.0設計RT-PCR擴增引物。引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成，預期擴增產(chǎn)物的長度795 bp。引物序列為：上游引物P1：5'-TTTTGGCATTCTCAGTTGTAGC-3'；下游引物P2：5'-CCATCTTGTCCCTGTTTGTAAG-3′。

1.4 反轉錄（Reverse transcription）

按照Transgen公司（中國）生產(chǎn)的EasyScript? First-Strand cDNA Synthesis SuperMix試劑盒說明書合成松材線蟲cDNA，反應體系為：Total mRNA 500 ng，Random Primer（N9）（0.1 μg·μl-1）1 μl，2×ES Reaction Mix 10 μl，EasyScript? RT/RI Enzyme Mix 1 μl，添加RNase-free Water至10 μl，輕輕混勻后置于25℃孵育10 min，42℃孵育30 min，85℃加熱5 min后冰上放置。

1.5 PCR擴增

以上述cDNA為模板進行PCR擴增，反應體系：Ex Tag Mix 25 μl，引物（10 μM）各1.0 μl，模板DNA 2.0 μl，補ddH2O至50 μl，反應條件為：95℃預變性5 min，95℃ 30 s，54℃ 30 s，72℃ 45 s，35個循環(huán)，最后72℃7 min。4℃保存PCR產(chǎn)物。

1.6 PCR產(chǎn)物的回收與純化

PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳后，利用凝膠成像系統(tǒng)在紫外燈下將目的片段切膠回收，用Axygen公司提供的AxyPrep DNA 凝膠回收試劑盒純化目的片段，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 目的基因的克隆與測序

在T4 DNA連接酶作用下使PCR產(chǎn)物與pMD19-T載體連接，然后轉染至大腸桿菌感受態(tài)細胞中，涂布在含有Amp 50 mg·L-1的X-gal/IPTG的LB培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)16 h。挑選3個白色單菌落進行菌液PCR，擴增產(chǎn)物送華大基因測序公司進行測序鑒定。

1.8 生物信息學分析

根據(jù)1基因的克隆測序結果，利用BioEdit軟件推導出1的氨基酸序列。利用ProtParam工具分析蛋白質的基本理化性質；利用Hopfield神經(jīng)網(wǎng)絡預測蛋白質的二級結構。利用Siss-model預測蛋白質的三級結構。利用SignalP v4.0，HMM 2.0和PSORTⅡ分別進行信號肽、蛋白質序列的跨膜區(qū)和亞細胞定位分析。從GenBank中下載其它物種的1基因序列，利用MEGA4軟件將克隆所得到的序列與GenBank上已發(fā)表的擬松材線蟲，燕麥真滑刃線蟲，馬鈴薯腐爛莖線蟲和鏈霉菌屬等序列進行同源性分析，并構建系統(tǒng)進化樹。

2 結果與分析

2.1 總RNA的提取

采用Trizol試劑法提取松材線蟲總RNA，經(jīng)紫外分光光度測定，其OD260/OD280比值為1.92，濃度為1 678 ng·μL-1，說明提取的總RNA質量合格，可以進行后續(xù)實驗。

2.2 RT-PCR擴增

以提取的松材線蟲總RNA為模板，反轉錄合成cDNA后進行PCR擴增，8 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果見圖1。由圖1可知，在750 bp ~ 1 000 bp之間，靠近750 bp處有較亮的特異性條帶，與預期的目的片段的大小（795 bp）一致。

圖1 松材線蟲果膠酶基因RT-PCR產(chǎn)物電泳

Figure 1 Electrophoresis of1 gene amplified by RT-PCR

2.3 陽性重組質粒測序結果比對及分析

將測序結果在NCBI中與松材線蟲已知序列[12]（Gen-Bank ID：AB232908.1）進行BLAST比對，結果二者之間的同源性為98%（圖2），說明本實驗成功克隆到松材線蟲1基因。BioEdit軟件分析表明，該序列GC含量為50.44%，編碼252個氨基酸，與擬松材線蟲的同源性為93%。

2.4 Bxpel1基因編碼產(chǎn)物的理化性質

通過相關生物信息學軟件（Bio-Edit）和在線網(wǎng)站（http://www.expasy.org）預測松材線蟲1基因編碼產(chǎn)物的理化性質。由1基因編碼產(chǎn)物的氨基酸組成（圖3）可知，1基因編碼252個氨基酸，組分中最多的氨基酸是Gly（甘氨酸），占全部組分的12.7%。1基因編碼的氨基酸理論等電點為8.43，理論分子質量約為26.68 ku。

2.5 Bxpel1基因編碼產(chǎn)物的二級結構預測

通過Hopfield神經(jīng)網(wǎng)絡（HNN）預測松材線蟲1基因編碼蛋白的二級結構，結果如圖4所示，上行為氨基酸序列，下行為其所對應的二級結構，其中h代表helix（α-螺旋），e代表extended（β-折疊），c代表coil（無規(guī)則卷曲）。從預測結果可知，1蛋白的二級結構中，α-螺旋占11.51%，β-折疊占35.32%，無規(guī)則卷曲占53.17%。

圖2 測序結果與已知序列的比對

Figure 2 Comparison of sequencing result between1 and knowns

圖3 Bxpel1蛋白氨基酸組成

Figure 3 Amino acid composition ofprotein

圖4 Hopfield神經(jīng)網(wǎng)絡（HNN）Bxpel1蛋白二級結構預測

Figure 4 Prediction of secondary structure of1 protein based on HNN

2.6 Bxpel1基因編碼產(chǎn)物的三級結構預測

蛋白質的三級結構是在α螺旋、β折疊、β轉角和無規(guī)則卷曲等二級結構基礎上通過側鏈基團的相互作用進一步卷曲、折疊而形成特定的構象。本研究利用SWISS-MODEL在線預測1結構域區(qū)的三級結構，結果如圖5顯示，1結構域區(qū)構成圓柱狀結構。

2.7 Bxpel1基因編碼產(chǎn)物信號肽分析

通過在線蛋白質序列信號肽分析工具SignalP4.1對1基因編碼產(chǎn)物的前70個氨基酸序列進行了分析，程序分別自動利用神經(jīng)網(wǎng)絡模型（NN）進行信號肽分析，并給出了3種C，Y，S-score計算結果。神經(jīng)網(wǎng)絡模型（NN）預測的信號肽結果如圖6所示，松材線蟲1編碼產(chǎn)物的分值曲線非常典型，C值為0.599，Y值為0.746，S值為0.970，其切割點位于第17至第18位的氨基酸之間，基本可以判定1編碼產(chǎn)物存在信號肽。

圖5 Bxpel1蛋白結構域區(qū)三級結構預測

Figure 5 Prediction of tertiary structure domain of1 protein

圖6 Bxpel1基因編碼產(chǎn)物信號肽分析

Figure 6 The signal peptide analysis ofl1 gene encoding protein

2.8 Bxpel1基因編碼產(chǎn)物跨膜結構的預測和分析

蛋白質的跨膜結構域一般由20 ~ 30個疏水氨基酸殘基組成，形成一螺旋固著于細胞膜上起錨定作用。通過使用TMPRED在線預測和分析了松材線蟲基因編碼蛋白質序列的跨膜區(qū)域。由圖7可知，1基因編碼的產(chǎn)物的0 ~ 25序列有可能是跨膜結構域，而其他序列均位于膜外。

圖7 Bxpel1蛋白跨膜區(qū)域分析

Figure 7 Transmembrane regional analyses of1 protein

2.9 松材線蟲Bxpel1基因編碼產(chǎn)物亞細胞定位分析

亞細胞定位的預測一般通過算法比較查詢序列中所包含的特征參數(shù)與各類相應的亞細胞定位的相似度，然后以一組概率值的形式作出判斷。通過工具PSORTⅡ預測，松材線蟲1基因編碼產(chǎn)物的亞細胞定位，見表1。從表1可知，其分布在細胞外的可能性為82.7%，分布在線粒體的可能性為4.3%，分布在內(nèi)質網(wǎng)的可能性為4.3%，分布在細胞核的可能性為8.7%。因此可以推斷，松材線蟲1基因編碼產(chǎn)物主要在細胞外發(fā)揮生物學作用。

表1 Bxpel1 編碼產(chǎn)物的亞細胞定位分析

2.10 松材線蟲Bxpel1基因編碼產(chǎn)物的分子進化分析

在NCBI網(wǎng)站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）下載擬松材線蟲、燕麥真滑刃線蟲、馬鈴薯腐爛莖線蟲和鏈霉菌屬的果膠酶基因的氨基酸序列，利用MEGA 4.0軟件將其與松材線蟲果膠酶基因編碼產(chǎn)物進行系統(tǒng)進化分析，并構建系統(tǒng)進化樹，如圖8。由圖8可知，松材線蟲與擬松材線蟲、燕麥真滑刃線蟲具有高度同源性，分子進化距離最近，關系最為密切，而與馬鈴薯腐爛莖線蟲和鏈霉菌屬進化距離相對較遠。

圖8 Bxpel1基因編碼產(chǎn)物的系統(tǒng)進化樹

Figure 8 The phylogenetic tree of1

3 結論與討論

果膠是植物細胞壁的主要構成成分之一，果膠酶基因廣泛存在于植物寄生線蟲基因組中，在線蟲入侵植物的過程中發(fā)揮著重要作用[13-15]。松材線蟲致病性相關的基因多是在食道腺細胞內(nèi)表達，然后其產(chǎn)物通過口針分泌到寄主體內(nèi)[16-20]。Taisei Kikuchi等[21]研究表明，1基因在松材線蟲食道腺細胞中表達，所編碼的多肽活性依賴于Ca2+，在pH值為8 ~ 10時具有最佳活性。松材線蟲將果膠酶分泌到植物的組織內(nèi)以助其取食與遷移，因此推斷果膠酶基因是松材線蟲關鍵致病相關基因。

本研究通過信號肽和跨膜結構的預測，分析基因編碼蛋白功能。通過對1基因編碼產(chǎn)物進行同源比對，發(fā)現(xiàn)1基因編碼產(chǎn)物的氨基酸序列與擬松材線蟲、燕麥真滑刃線蟲的1蛋白序列具有高度同源性，這種同源性在一定程度上代表著物種親緣關系的遠近，同時也反映了1編碼產(chǎn)物在不同物種結構上的穩(wěn)定性對生物體的功能重要性。結果表明，1基因編碼產(chǎn)物由252個氨基酸組成，其等電點為8.43，分子質量約為26.68 ku。1基因編碼產(chǎn)物二級結構主要是以無規(guī)則卷曲和β-折疊為主，主要在細胞外發(fā)揮生物學作用，并且預測出信號肽的剪切位點位于第17至第18位的氨基酸之間，已知信號肽位于分泌蛋白的N端，它對于外分泌蛋白的分泌起主導作用[22-23]。利用生物信息學的方法對松材線蟲1基因的編碼產(chǎn)物序列進行分析，可以了解其蛋白質結構和功能，結果對進一步研究闡明1基因松材線蟲致病過程中的功能及松材線蟲病的分子致病機理具有重要意義，同時為以后試驗方案的制定提供了重要理論依據(jù)。

[1] ZHU L h，YE J r，NEGI Sapan，. Pathogenicity of aseptic[J]. PLoS ONE，2012，7（5）：e38095.

[2] PEREIRA F，MOREIRA C，F(xiàn)ONSECA L，. New insights into the phylogeny and worldwide dispersion of two closely related nematode species,and[J]. PLoS ONE，2013，8（2）：e56288．

[3] MALLEZ S，CASTAGNONE C，ESPADA M，. First insights into the genetic diversity of the pine wood nematode in its native area using new polymorphic microsatellite loci[J]. PLoS ONE，2013，8（3）：e59165.

[4] Qiu X W，Wu X Q，Huang L，. Specifically expressed genes of the nematodeinvolved with early interactions with pine trees[J]. PLOS ONE，2013，8（10）：e78063．

[5] Qiu X W，Wu X Q，Huang L，. In?uence of1 Gene Silencing by dsRNA Interference on the Development and Pathogenicity of the Pine Wood Nematode,[J]. Int J Mol Sci，2016（17）：125.

[6] BARRAS F，VAN GIJSEGEM F，CHATTERJEE A K. Extracellular enzymes and pathogenesis of soft-rot Erwinia[J]. Ann Rev Phytopathol，1994，32（1）：201－234.

[7] DAVIS E L，HUSSEY R S，BAUM T J. Getting to the roots of parasitism by nematodes[J]. Trends Parasitol，2004，20（3）：134－141.

[8] POPEIJUS H，OVERMARS H，JONES J，. Enzymology: degradation of plant cell walls by a nematode[J]. Nature，2000，406（6791）：36－37.

[9] DE BOER J M，DAVIS E L，HUSSEY R S，. Cloning of a putative pectate lyase gene expressed in the subventral esophageal glands of[J]. J Nematol，2002，34（1）：9.

[10] DOYLE E A，LAMBERT K N. Cloning and characterization of an esophageal-gland-specific pectate lyase from the root-knot nematode[J]. Mol Plant-Microb Interact，2002，15（6）：549－556.

[11] 曹會萍，常衛(wèi)華，馬呈瑞，等. 綿羊性腺褪黑素受體基因 MT2 的克隆及其生物信息學分析[J]. 中國獸醫(yī)科學，2013，43（12）：1295－1300.

[12] KIKUCHI T，SHIBUYA H，AIKAWA T，. Cloning and characterization of pectate lyases expressed in the esophageal gland of the pine wood nematode[J]. Mol Plant-microb Interact，2006，19（3）：280－287.

[13] JONES T M，ANDERSON A J，ALBERSHEIM P. Host-pathogen interactions IV. Studies on the polysaccharide-degrading enzymes secreted byf. sp. Lycopersici[J]. Physiol Plant Pathol，1972，2（2）：153－166.

[14] TOMASSSINI A，SELLA L，RAIOLA A，. Characterization and expression of Fusarium graminearum endo-polygalacturonases in vitro and during wheat infection[J]. Plant Pathol，2009，58（3）：556－564.

[15] 邱秀文，吳小芹，黃麟，等. 松材線蟲2基因的克隆及ＲNA干擾載體構建[J]. 林業(yè)科學，2016，29（29）：283－288.

[16] 王仕利，曹福祥，王猛，等. 松材線蟲基因研究進展[J]. 中南林業(yè)科技大學學報，2009，29（3）：195－198.

[17] JONES J T，MONES M，MOTA M，.: opportunities in comparative genomics and molecular host-parasite interactions[J]. Mol Plant Pathol，2008，9（3）：357－368.

[18] SANTOS C S，PINHEIRO M，SILVA A I，. Searching for resistance genes tousing high throughput screening[J]. BMC Genomics，2012，13（1）：599.

[19] KIKUCHI T COTTON J A，DALZELL J J，. Genomic insights into the origin of parasitism in the emerging plant pathogen[J]. PLoS Pathog，2011，7（9）：e1002219.

[20] 馬海賓. 松材線蟲纖維素酶系及其cDNA基因的克隆與RNA干擾研究[D]. 北京：中國林業(yè)科學研究院，2008.

[21] KIKUCHI T，SHIBUYA H，AIKAWA T，. Cloning and characterization ofexpressed in the esophageal gland of the pine wood nematode[J]. Mol Plant-microbe Interact，2006，19（3）：280－287.

[22] IZARD J W，DOUGHTY M B，KENDALL D A. Physical and conformational properties of synthetic idealized signal sequences parallel their biological function[J]. Biochemistry，1995，34（31）：9904－9912.

[23] 楊運桂，徐京寧，胡泰山. 信號肽疏水性的提高促進青霉素G酰化酶分泌[J]. 生物化學與生物物理學報，2000，32（2）：163－168.

Cloning and Bioinformatics Analysis of1 Gene from

QIU Xiu-wen1,2,3，ZHOU Gui-xiang1,2,3，WANG Hui-juan3，YANG Li-li3

( 1. Poyang Lake Eco-economy Research Center, Jiujiang University, Jiujiang 332005, China; 2. Jiujiang Key Laboratory of Basin Management and Ecological Protection, Jiujiang University, Jiujiang 332005, China; 3. School of Chemistry and Environmental Engineering, Jiujiang University, Jiujiang 332005, China）

1 gene sequence fromcDNA as a template was amplified and cloned by RT-PCR.1 gene (795bp) was successfully cloned with GC content of 50.44% and encode of 252 amino acids. The cloned sequence had 98% similarity to the pel1 gene previously published in the GenBank (ID: AB232908.1). Phylogenetic analysis showed that1 had high homologies with that fromand.1 gene encode from 0 to 25 sequences may be transmembrane structure, while the other sequences outside membrane. The secondary and tertiary structures were abundant in random coils and beta helix. The signal peptide cleavage sites locate between No. 17 to No. 18 amino acid and performs biological effects at extracellular.

;1 gene; clone; bioinformatics

10.3969/j.issn.1001-3776.2018.04.002

S763

A

1001-3776（2018）04-0008-07

2017-12-25；

2018-05-25

國家自然科學基金項目（31660205）；江西省自然科學基金項目（20161BAB214152，20151BAB213018）

邱秀文，副教授，從事森林病理相關研究；Ｅ-mail：qiuxiuwen3@163.com。

周桂香，副教授，從事森林生態(tài)相關研究；Ｅ-mail：727424712@163.com。