‘冀桑2號’嫁接苗對NaCl脅迫的生理響應

賈漫麗，李 娜，李季生，王 軍，楊貴明

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‘冀桑2號’嫁接苗對NaCl脅迫的生理響應

賈漫麗1,2，李 娜1,2，李季生1,2，王 軍3，楊貴明1,2

（1. 河北省高校特產蠶桑應用技術研發中心，河北 承德 067000；2. 承德醫學院蠶業研究所，河北 承德 067000；3. 河北省木蘭圍場國有林場管理局四合永林場，河北 承德 068450）

2014年4月，在河北省承德市，將‘冀桑2號’‘Jisang 2’嫁接在‘冀桑3號’‘Jisang 3’的砧木上。嫁接苗于次年4月移栽于盆中并置于防雨棚下。2015年6月，分別用質量濃度0.0%（CK），0.2%，0.3%，0.4%的NaCl溶液處理試驗苗木28 d，處理后每隔7 d取樣一次并檢測各項生理指標。結果表明：隨著NaCl脅迫時間的增加，‘冀桑2號’葉片中的相對電導率和丙二醛（）含量不斷上升；超氧化物歧化酶（）、過氧化物酶（）、過氧化氫酶（）的活性先上升后下降，游離脯氨酸和可溶性糖含量先上升后下降；可溶性蛋白呈下降趨勢。

‘冀桑2號’；耐鹽性；NaCl脅迫；生理特性

土壤鹽化是影響和限制植物生長的自然逆境之一，也是世界性的環境問題和生態問題[1-2]。近年來，對耐鹽植物品種的選育和栽培技術研究越來越受到關注，在土壤含鹽量為0.3%時便會影響大多數植物的正常生長[3-4]。而植物本身在鹽脅迫過程中也會產生一定的耐受性及適應機制，如脯氨酸、可溶性糖等滲透調節物質的合成，可以調節細胞內外鹽分濃度的平衡；酶保護系統的形成，可以清除細胞在脅迫過程中產生的過多的活性氧，保護細胞和組織免受氧化損傷。桑是桑科Moraceae桑屬多年生雙子葉木本植物，具有較強的抗逆性。近幾年來，隨著開展蠶桑資源的多元化利用[5]，桑不僅作為家蠶唯一飼料樹種，同時也是果葉兼用，以及沙漠化及鹽堿化土地生態治理的優良樹種。林天寶等[6]對廣西4個桑品種的耐鹽性進行了比較，根據各項生理生化指標進行隸屬函數分析，耐鹽高低順序為：‘桂桑優12’＞‘桂桑優62’＞‘桑特優2號’＞‘桑特優1號’。李衛國等[7]研究表明，桑品種‘農桑14號’、‘昂綠1號’、‘湖桑32號’、‘魯插1號’葉片中滲透調節物質隨鹽分脅迫時間長短而變化，且品種間具有顯著差異。

‘冀桑2號’‘Jisang 2’是河北省農林科學院特產蠶桑研究所（現承德醫學院蠶業研究所）培育而成，1998年通過河北省樹木良種審定。豐產性能好，葉質優良，耐寒性強，適宜遼寧以南、黃河中、下游地區，是適宜條桑育、密植型的桑新品種，具有良好的推廣種植前景。目前，關于‘冀桑2號’的研究主要集中在不同部位的含水量、物候期以及抗旱性等方面[8-9]，而有關鹽脅迫方面的系統研究尚未見報道。因此，本研究以‘冀桑2號’嫁接苗為試驗材料，脅迫時間為28 d，參考前人研究的桑樹品種的耐鹽閾值設定3個鹽濃度水平（0.2%，0.3%，0.4% NaCl質量分數），通過控制培養實驗和儀器檢測分析，研究非致死濃度下脅迫時間對‘冀桑2號’生長和生理特性的影響，綜合評價其耐鹽能力，為桑耐鹽性品種的篩選提供依據，同時為鹽堿地區引種馴化及抗性研究提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗在河北省承德醫學院蠶業研究所5#試驗地進行，40°12′ ~ 42°37′ N，115°54′ ~ 119°15′ E。屬暖溫帶半濕潤季風氣候，年平均氣溫9℃，四季分明，晝夜溫差較大，年平均降水量380 mm，70%集中在夏季。

1.2 試驗材料

供試材料為‘冀桑2號’嫁接苗，接穗選用‘冀桑2號’，以1年生雜交實生桑‘冀桑3號’‘Jisang 3’的根作為砧木，遺傳背景清晰，性狀表現一致。兩者均為承德醫學院蠶業研究所培育并審定的品種，親和力較強。

2014年1月，選剪直立的、冬芽飽滿無損、表皮完好的‘冀桑2號’1年生枝條為接穗貯存于地窖，4月20日左右進行苗木嫁接。嫁接選用袋接法，在接穗芽苞膨大、樹液開始流動時進行。砧木在青黃交接處剪成50°的斜面，剪口平滑，將接穗4刀削成標準狀，插入砧木，插實插牢。嫁接完成后將嫁接苗植于大田，用濕土把接口以上接穗部位擠牢，然后覆蓋接穗，覆土厚度為2 cm左右，常規管理1 a。

2015年4月，選取長勢一致、無病蟲害的苗木進行移栽，種植盆為PP材質，長58 cm，寬38.5 cm，高33.5 cm，每盆6株，盆底部有通氣孔并配有托盤，防止鹽分流失。盆內基質為培養土和園土以1:1混合，園土為含有養分較少的沙壤土，pH值6.5 ~ 7.0，有機質含量>4.5%。苗木截干高度40 cm左右，發芽后每株保留3個新梢。5月中旬將試驗苗木移至防雨棚下。

1.3 試驗設計

2015年6月，對試驗苗木進行鹽脅迫處理。脅迫處理前采取自然干旱的辦法控水3 ~ 5 d。設3個處理，T1，T2，T3分別用分析純NaCl配制成質量分數為0.2%，0.3%，0.4%的NaCl溶液，清水為對照（CK）。每個處理4個重復，每盆6株，共計24株，隨機排列。試驗開始時用相應濃度的NaCl溶液預先透灌，使盆內土壤的含鹽量達到預定梯度，實驗開始后每隔1 d監測1次土壤含鹽量，并及時補鹽補水。在盆土含鹽量達到預定梯度后的第0天、第7天、第14天、第21天、第28天的7:00進行取樣。隨機取新梢第4至第6片正常生長的成熟葉片進行各項生理指標的測定，試驗重復3次。

1.4 測定方法

分別于NaCl脅迫第0天和第20天測量已標記好的苗木高度，每個水平測定3株。苗木新梢生長量按下列公式計算：

＝20d－0d

式中，為新梢生長量；20d為第20天測定的苗高；0d為第0天測定的苗高。

細胞膜透性采用電導法（DDSJ-308F）測定[10]；丙二醛（）含量的采用測定硫代巴比妥酸（TBA）比色法[12]；超氧化物歧化酶（）、過氧化物酶（）、過氧化氫酶（）活性的測定分別采用氮藍四唑（NBT）光化還原法、紫外分光光度法[10]和愈創木酚比色法[11]；游離脯氨酸、可溶性糖及可溶性蛋白含量測定分別蒽酮比色法、酸性茚三酮法和考馬斯亮藍G-250染色法[12]。

采用SPSS 18.1和Excel進行數據處理和分析。

2 結果與分析

2.1 NaCl脅迫下‘冀桑2號’苗木新梢生長量的變化

由表1可知，隨著NaCl濃度的增加，‘冀桑2號’苗木的新梢生長量和新梢生長增長率均呈下降趨勢。在NaCl脅迫第20天時，與CK相比，0.2%，0.3%，0.4%水平下的新梢生長增量分別下降了27.78%，30.56%，38.89%。說明‘冀桑2號’的新梢生長受到NaCl脅迫的抑制。

表1 NaCl脅迫對‘冀桑2號’苗木新梢生長量的影響

2.2 NaCl脅迫下‘冀桑2號’葉片相對電導率和MDA含量的變化

‘冀桑2號’葉片的相對電導率隨著NaCl脅迫時間的延長總體上呈上升趨勢（圖1A）。NaCl脅迫前期（7 d），各鹽處理的相對電導率變化較小，基本上維持在一個相對穩定的水平，脅迫第14天時，與CK相比，T1，T2，T3各處理組的相對電導率分別增加了15.74%，26.57%和31.54%；長時間的NaCl（14 ~ 21 d）脅迫導致相對電導率迅速增大，脅迫第28天時，各處理分別比CK增加了40.83%，69.92%和78.31%，差異顯著（<0.05）。

圖1 不同時期NaCl脅迫對‘冀桑2號’葉片相對電導率及MDA含量的影響

Figure 1 Effect of NaCl stress on membrane permeability andcontent in leaf of‘Jisang 2’ seedlings

在T1，T2，T3各處理下，‘冀桑2號’葉片中含量隨著NaCl脅迫時間的延長，表現出逐漸上升的趨勢（圖1B）。在脅迫0 ~ 7 d，T1，T2，T3處理葉片的含量上升緩慢，分別比CK增加了7.63%，17.88%和28.54%，與CK間差異不明顯（>0.05）。而在NaCl脅迫14 ~ 21 d時，‘冀桑2號’葉片含量顯著增加，T1，T2，T3處理分別比CK增加了17.84%，44.45%，53.19%，到第28天時出現急劇上升，T1，T2，T3處理分別比CK增加了36.16%，51.22%，58.38%，極顯著高于CK（<0.01）。

2.3 NaCl脅迫下‘冀桑2號’葉片中抗氧化酶活性的變化

隨著NaCl脅迫時間的延長，T1，T2，T3各處理中‘冀桑2號’葉片的活性先升高后降低（圖2A），CK中活性在脅迫過程中有較小升高趨勢。NaCl脅迫初期（0 ~ 7 d）開始T1和T2，處理下‘冀桑2號’的酶活性迅速升高，并在處理的第21天達到高峰值420.447，396.966 u·g-1·min-1FW，分別比CK提高了93.31%，82.512%，差異達到極顯著水平（<0.01），之后酶活性不斷降低。而T2處理下，脅迫0 ~ 14 d時‘冀桑2號’的酶活性呈緩慢上升趨勢，在處理14 ~ 21 d時酶活性迅速升高，并在第21天時達到高峰值336.576 u·g-1·min-1FW，比CK增加了54.75%，之后酶活性不斷降低，但始終高于CK。

圖2 不同時期的NaCl脅迫對‘冀桑2號’葉片SOD，POD和CAT活性的影響

Figure 2 Effect of NaCl stress on the activity of,andin leaf of‘Jisang 2’ seedlings

NaCl脅迫能夠提高‘冀桑2號’的酶活性（圖2B），各處理下‘冀桑2號’的活性隨著NaCl脅迫時間的延長而增加，T1，T2，T3處理在脅迫第14天時分別達到高峰值93.759，136.078，113.396 u?g-1FW，之后開始持續下降，到達高峰值時各處理分別比CK增加了46.19%，112.17%，76.81%，均顯著高于CK（< 0.05）。

隨著NaCl處理時間的延長，各處理水平‘冀桑2號’葉片的活性變化呈先上升后下降的趨勢（圖2 C），并且高峰值出現在脅迫處理后的第21天，到達峰值時各處理的活性分別比CK增加了52.55%，75.57%，67.56%，差異達到極顯著水平（<0.01），之后持續下降，但仍高于CK。

2.4 NaCl脅迫下‘冀桑2號’葉片滲透調節物質含量的變化

如圖3 A，在T1，T2，T3處理下，脅迫初期（0 ~ 7 d）‘冀桑2號’葉片的可溶性糖含量顯著上升，第14天時分別達到高峰值7.878%，7.190%，6.824%，到達峰值時各處理的可溶性糖含量與CK相比增加了21.41%，10.80%，5.16%。T1，T2處理組與CK間差異顯著（<0.05），而T3處理組與CK差異不顯著（>0.05）。當脅迫持續一定時間（14 d）之后各處理組可溶性糖含量又逐漸下降，脅迫第28 d時迅速下降，達到3.861%，4.048%，3.789%，與CK相比降低了23.13%，17.44%，25.47%，差異顯著（<0.05）。

圖3 不同時期的NaCl脅迫對‘冀桑2號’葉片可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸含量的影響

Figure 3 Effect of NaCl stress on the content of soluble sugar, soluble protein and proline in leaf of‘Jisang 2’ seedlings

NaCl脅迫初期（0 ~ 7 d），各處理組‘冀桑2號’葉片可溶性蛋白含量小幅上升，而后隨著脅迫時間越長，一直呈下降趨勢（圖3B），并始終低于CK，且處理間差異較小。在NaCl處理第14天時，T1，T3處理可溶性蛋白含量分別為18.393，17.718 mg?g-1FW，分別比CK降低了15.85%，20.26%，而T2處理可溶性蛋白含量為19.773 mg?g-1FW，比CK降低了7.76%。在處理的14 ~ 21 d，T1，T3處理的可溶性蛋白含量先上升后顯著下降，而T2處理一直呈下降趨勢。脅迫第28天，T1，T2，T3各處理組的可溶性蛋白含量分別為15.090，13.643，14.420 mg?g-1FW，比CK降低了14.80%，26.97%，20.13%，差異達到顯著水平（<0.05）。

在CK處理下，‘冀桑2號’葉片中脯氨酸含量很低，隨著NaCl脅迫時間的延長，各處理組葉片中的脯氨酸開始大量積累（圖3C）。脅迫第14天時，T1，T2，T3處理組葉片脯氨酸含量分別達到326.698，357.749，451.973 μg·g-1FW，比CK增加了169.42%，195.03%，272.73%。各處理組在脅迫第21天時達到高峰值528.996，651.369，784.954 μg·g-1FW，到達峰值時，分別比CK增加了181.32%，246.40%，317.44%，與CK間差異極顯著（<0.01）。當NaCl脅迫持續21 ~ 28 d，葉片中脯氨酸含量開始下降，但仍顯著高于CK（<0.05）。

3 結論與討論

3.1 結論

試驗結果表明：各濃度水平下的NaCl脅迫均可顯著抑制‘冀桑2號’的新梢生長，濃度越大其新梢生長量受抑制越明顯，其中0.4%的NaCl脅迫下葉片顏色有變黃現象。并且隨著脅迫時間的延長，‘冀桑2號’葉片的細胞膜透性、膜脂過氧化程度顯著增加；保護酶活力顯著升高后又降低；其滲透調節物質游離脯氨酸和可溶性糖含量先上升后下降；可溶性蛋白含量顯著降低，說明‘冀桑2號’對NaCl脅迫產生了一定的生理響應。

3.2 討論

在逆境脅迫條件下，植物細胞因為膜脂過氧化作用而產生的，可作為植物細胞膜受損和自由基形成的主要指示物[13]。在本研究中，質量分數0.2%，0.3%，0.4%的NaCl脅迫下，‘冀桑2號’葉片中含量均高于CK。在脅迫初期（0 ~ 7 d），含量雖高于CK，但各個處理之間差異不顯著，可見短時間的NaCl脅迫對‘冀桑2號’膜脂過氧化作用的影響較小。隨著脅迫時間的延長，在脅迫中后期（14 ~ 28 d）時，含量顯著升高，與CK相比達到極顯著水平（<0.01），表明在脅迫后期，植物細胞的生理生化調節能力下降，受到膜脂過氧化作用加強，細胞的膜穩定性下降。林天寶等[6]研究不同濃度NaCl脅迫下廣西‘桑特優1號’，‘桑特優2號’，‘桂優12’和‘桂優62’葉片中含量的變化呈上升趨勢，本研究結果與之相符合。

抗氧化酶系統是決定細胞對脅迫抗性的關鍵因素[14]，在植物遭遇逆境脅迫時，各種保護酶之間可產生協同作用，來降低或清除活性氧的產生，以此降低逆境脅迫對植物造成的傷害[15]。NaCl脅迫初期，‘冀桑2號’葉片細胞中的三種酶活性較高，相對電導率較低，說明細胞自身能夠通過提高酶的活性來清除細胞內多余的活性氧自由基，三種保護酶是對NaCl脅迫非常敏感的生理指標。隨著NaCl脅迫時間的延長，酶的活性達到高峰值后又迅速下降，而相對電導率則迅速升高，說明長時間的鹽脅迫對三種保護酶的活性有較大的影響，活性氧自由基的產生量超過了酶的清除閾值，使得細胞受損，酶的活性受到抑制，‘冀桑2號’調節能力開始下降，細胞膜傷害加劇。與朱金方等[16]對中國檉柳、劉玉艷等[17]對紫花地丁的研究結果相同。

脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白是植物體內存在的滲透調節物質，當機體遭遇逆境環境時，體內的滲透調節物質進行大量積累[18-19]，以此降低細胞滲透勢，維持細胞滲透平衡，是植物的一種耐鹽生理機制[20]。本試驗中，從脅迫初期開始，‘冀桑2號’葉片脯氨酸的含量緩慢增加，可溶性糖含量迅速升高后再降低，到脅迫后期與CK相比無顯著差異。說明在等濃度NaCl處理下隨著脅迫天數的增加，可溶性糖先于脯氨酸積累，也先于脯氨酸停止積累，兩種物質的積累進程不同，在滲透調節方面可能存在著互補作用[21]。‘冀桑2號’葉片可溶性蛋白含量總體下降，因為NaCl脅迫會加速分解植物體內的可溶性蛋白，而脅迫后期（14 ~ 21 d），葉片可溶性蛋白含量又有小幅上升，原因可能是葉片細胞內正常蛋白的解體，而長期的NaCl脅迫誘導產生了一定量的新蛋白。研究結果與李衛國[8]等對NaCl脅迫下4個桑樹品種（‘農桑14號’、‘昂綠1號’、‘湖桑32號’、‘魯插1號’）葉片內滲透調節物質含量的變化結論符合。

植物對鹽脅迫的響應是一個十分復雜的生理過程[22]，已有的研究表明長期的NaCl脅迫會影響植物正常生長，高濃度NaCl脅迫可致植物葉片變黃、焦枯、落葉甚至死亡[23]。本試驗設置的土壤鹽分濃度尚未達到桑樹鹽害的臨界濃度，葉片未見脫落，未見單株死亡。在后續研究中可以增加NaCl濃度水平，增大濃度梯度極差，以得到‘冀桑2號’能夠正常生長的抗鹽閾值及存活閾值。此外，延長脅迫時間，同時進行宏觀指標的調查，并進一步到鹽堿地大田中進行試驗，可以進一步驗證本試驗結果的準確性，也可為今后開展耐鹽性桑樹新品種選育以及‘冀桑2號’在濱海鹽堿地的推廣提供理論依據。

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Physiological Responses of Grafted‘Jisang 2’ Seedlings to NaCl Stress

JIA Man-li1,2，LI Na1,2，LI Ji-sheng1,2，WANG Jun3，YANG Gui-ming1,2

（1. Hebei Universities R&D Centre for Sericulture and Specialty Enabling Technologies, Chengde 067000, China; 2. Institute of Sericulture, Chengde Medical University, Chengde 067000, China; 3. Hebei Mulan Paddock State-owned Forest Centre Administration, Chengde 068450, China）

Scions of‘Jisang 2’ were grafted in stocks of‘Jisang 3’ in April of 2014 in Chengde, Hebei province. Grafted seedlings were transplanted in pot under rain-proof shed in the April of the next year. In June of 2015, seedlings were treated with 0 (control)，0.2%，0.3% and 0.4%NaCl solutions of NaCl for 28 days, and physiological parameters were detected each 7 days after treatment. The results showed that relative conductivity and malondialdehyde () content in leaves of‘Jisang 2’ increased with stress duration of NaCl, while the activities of superoxide dismutase (), peroxidase () and catalase () increased first and then decreased, as well as the content of free proline and soluble sugar, and soluble protein decreased.

‘Jisang 2’; salt tolerance; NaCl stress; physiological property

10.3969/j.issn.1001-3776.2018.04.004

S888.2

A

1001-3776（2018）04-0021-07

2017-11-14；

2018-05-25

賈漫麗，碩士研究生，助理研究員，從事蠶桑資源評價與利用研究；E-mail：94789458@qq.com。

楊貴明，碩士，研究員，從事蠶桑資源綜合利用研究；E-mail：seri999@163.com。