膠原蛋白止血海綿在豬肝臟出血模型中止血效果研究

林振華，侯麗，董傳俊，魏振西，朱福余，褚祥宇，展榮凱

山東省醫療器械產品質量檢驗中心/山東省醫療器械生物學評價重點實驗室，山東 濟南 250101

引言

膠原蛋白主要分布于皮膚、肌腱等組織，經過病毒滅活、去脂、酶切等工藝制備而成。由于去除了能夠引起免疫原性的端肽，具有低免疫原性和可降解性。膠原蛋白止血海綿狀結構具有良好的滲水和吸水能力，局部止血時能很好的吸收出血，同時加強血小板的粘附和聚集，并啟動內源性的止血途徑，從而達到止血效果[1-2]。目前膠原蛋白已被廣泛應用于制備醫療材料，其生物安全性等優點已被廣泛認可，但是作為可降解的止血材料，其止血有效性在大動物出血模型中，需要繼續研究。將兩組不同的膠原蛋白海綿及普通紗布用于豬的肝臟出血模型中進行比較研究，來進一步確認膠原蛋白作為止血材料的優勢。

1 材料和方法

1.1 主要材料和儀器

呼吸麻醉機（型號WATO EX-20，深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司），獸用便攜式多參數監護儀（型號iMEC8 Vet，深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司），壓力傳感系統（LCKD-1kg型壓力表，DP25B-S-230型壓力傳感器，OMEGA），分析天平（型號JA2003N，200 g，上海精密科學儀器有限公司），正置顯微鏡（型號BX53/DP73，日本Olympus），TissUE-Tek自動組織染色封片工作站（型號Tissue-Tek Prisma 6133-Glas g2，日本櫻花精機會社），HM355S全自動切片機（型號HM355S，美國賽默飛世爾），組織脫水機（型號Excelsior AS，美國Thermo），自動組織包埋機（型號Histostar，美國Thermo）。A組膠原蛋白海綿（4.5 cm×4.5 cm×0.5 cm，廣州創爾生物技術股份有限公司），B組醫用膠原蛋白海綿（100 mm×50 mm×5 mm，上海其勝生物制劑有限公司），無菌紗布（6 cm×8 cm，8層A型）。

1.2 實驗動物及分組

普通級實驗用小型豬18頭[天津市百農實驗動物繁育科技有限公司，許可證號：SCXK（津）2015-0002]，雌性未孕，體重30～40 kg，隨機分為A、B、C三組：A組為膠原蛋白海綿組；B組為醫用膠原蛋白海綿組；C組為普通紗布組。每組6頭。本研究獲得山東省醫療器械產品質量檢驗中心動物倫理委員會批準，實驗過程中動物的處理符合倫理要求。

1.3 實驗方法

1.3.1 出血模型的建立

動物術前24 h禁飼不禁水。按0.5 mL/kg的劑量，通過耳靜脈一次性注射丙泊酚注射液進行誘導麻醉。誘導麻醉后，進行氣管插管，連接呼吸麻醉機，使用異氟烷進行氣體維持麻醉。動物仰臥位，于肝臟相應皮膚部位剃毛，備皮區約15 cm×20 cm，清潔后用碘伏進行徹底消毒，鋪上蓋單、洞巾等，暴露切口部位。確認動物麻醉（肌肉松弛）后，于暴露切口部位做約4 cm切口，鈍性分離腹外斜肌和內斜肌，剪開腹膜，暴露肝臟。將肝臟用手術刀劃出長2 cm，深3 mm的傷口（傷口部位在距肝臟邊緣3 cm處）。

1.3.2 止血方法

A組于10 s內將一片膠原蛋白海綿完全覆蓋在傷口上，并覆蓋無菌紗布塊，使用壓力傳感系統進行按壓，按壓力度為（10±2）N。每30 s觀察一次止血情況（僅拿開無菌紗布塊觀察止血情況），如未能止血，繼續覆蓋另一塊無菌紗布塊按壓，直至止血（連續觀察10 min，仍不能有效止血則視為不能止血）。止血后記錄止血時間及出血量。B組同法操作；C組僅使用無菌紗布同法操作。

1.4 主要觀察指標

1.4.1 止血時間

觀察并記錄止血時間，以時間單位（s）記錄止血時間。使用秒表讀數方式觀察并記錄止血時間。

1.4.2 出血量

觀察并記錄出血量[3]，以重量單位（g）記錄出血量。先將無菌紗布稱重，止血完成后，將帶有血液的無菌紗布再次稱重。止血后無菌紗布的重量減去止血前無菌紗布的重量即為出血量。

1.4.3 病理學檢查

術后8周，采用安樂死的方法處死所有動物，進行病理學檢查，觀察創面血性莢膜形成情況，取肝臟創面用10%中性福爾馬林固定，HE染色，觀察炎癥反應情況和創口愈合情況等。

1.5 統計學分析

使用SPSS 17.0對止血時間、出血量（表示為x-±s）進行統計學分析，當P＜0.05時表示有顯著性統計學差異。

2 結果

2.1 止血時間和出血量

A組和C組止血時間和出血量均有顯著性統計學差異（P＜0.05），結果見表1。B組和C組止血時間和出血量均有顯著性統計學差異（P＜0.05），結果見表2。

表1 A組和C組肝臟止血時間和出血量結果

2.2 病理學檢查

取肝臟創面用10%的中性福爾馬林固定液固定，將固定后的組織經石蠟包埋后切片，采用常規蘇木素—伊紅染色法進行染色，在光學顯微鏡下觀察各組動物肝臟的創口周邊組織學反應情況，結果如下。

A組創口處可見結締組織增生，可見少量增生的膠原纖維及成纖維細胞，可見少量含鐵血黃素沉著，未見感染性炎癥反應，見圖1。

B組創口處纖維結締組織增生，被膜增厚，可見少量增生的膠原纖維及成纖維細胞，創口處可見少量含鐵血黃素沉著，未見感染性炎癥反應，見圖2。

C組可見結締組織增生，可見少量含鐵血黃素沉著，未見感染性炎癥反應，見圖3。

圖2 B組創口處染色結果

圖3 C組創口處染色結果

病理學檢查結果顯示，A、B、C三組肝臟創面均未見血性莢膜形成，肝臟創口未出現感染性炎癥反應，肝臟創口愈合良好。

3 討論

本次研究選擇豬的肝臟損傷出血模型符合研究預期要求，肝臟屬于實質性器官，結構復雜，功能繁多，有較大的動、靜脈，也有豐富的毛細血管，具有豐富的血流[4]。未選擇小動物肝臟出血模型進行研究，主要考慮小動物血容量小，出血時間和出血量相對偏小，模型具有局限性。

止血是血管、血小板及凝血因子的共同作用來完成[5]。其中，血小板在初期止血過程中起著重要的作用。止血過程中除了局部的加壓和止血材料的促凝作用外，還與止血材料的結構有重要關系[6]。常規臨床手術中，大血管可以結扎阻斷，但不能解決毛細血管的止血問題[7]。通過本次研究可知，以膠原蛋白為材料的止血海綿能夠較快速的解決實質性臟器的出血問題，明顯優于普通紗布，為臨床手術節省大量時間。

臨床常用的可吸收止血材料有氧化纖維素、凝血酶制劑、膠原蛋白海綿、微孔多聚糖類止血粉、殼聚糖等[8]。眾多止血材料中，膠原蛋白有很好的生物學性能，具有可降解、低抗原、生物相容性良好等優點[9-16]。膠原蛋白獨特的三維網狀多孔結構能夠吸附大量的組織液，能更有效地達到止血目的。此次研究結果表明以膠原蛋白為材料的止血海綿的止血有效性較普通紗布好，有明顯的止血作用，并且對創傷的副作用較小，符合臨床預期使用要求。