內(nèi)蒙古地區(qū)馬鈴薯黑痣病立枯絲核菌融合群及致病性研究

曹春梅，王曉嬌，許 飛，逯春杏，陳 銘

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010031；2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018；3.內(nèi)蒙古呼和浩特武川縣農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，內(nèi)蒙古 武川 011700）

馬鈴薯黑痣病是由立枯絲核菌（Rhizoctonia solani Kuhn）引起的一種土傳和種子傳播的真菌性病害[1]，立枯絲核菌是Kuhn[2]于1858年發(fā)現(xiàn)的一個新種，是以菌絲或菌核形態(tài)在土壤中習(xí)居。該菌的寄主范圍廣闊，形態(tài)特征存在較大的差異，日本的生越明[3]根據(jù)立枯絲核菌的形態(tài)特征，形成了一套具體而統(tǒng)一的鑒定標準，可準確鑒定立枯絲核菌，這些立枯絲核菌的分類特征在全世界已經(jīng)獲得共識，沿用至今。菌絲融合群（Anastomosis group，簡稱AG）是指當兩個菌株配對培養(yǎng)時，光學(xué)顯微鏡下可觀察到菌絲生長和交疊現(xiàn)象[4]。生越明[3]根據(jù)菌絲融合的特性建立了立枯絲核菌的菌絲融合群，并根據(jù)融合群內(nèi)不同的融合頻率、培養(yǎng)性狀、致病性等劃分為不同的亞群。到1999年，已報道的立枯絲核菌被分為14個菌絲融合群，即AG-1～AG-13和AG-BI[5]。

侵染馬鈴薯引起黑痣病的立枯絲核菌，在不同國家和地區(qū)病原菌的融合群也有所不同，Balali等[6]報道侵染澳大利亞馬鈴薯黑痣病的融合群為AG-3、AG-4和AG-5，分別占90%、7%和2%。Yanar等[7]研究鑒定出土耳其侵染馬鈴薯黑痣病有11個融合群，其中AG-3占83.9%，AG-2-1占5.6%，其他融合群分離到的菌株比例不到5%。Campion等[8]和Bandy等[9]研究發(fā)現(xiàn)，從來自美國和法國的馬鈴薯黑痣病上分離得到AG-3，AG-5和AG-2-1融合群。Virgen-Calleros等[10]對墨西哥馬鈴薯黑痣病進行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)優(yōu)勢融合群為AG-3，占73.5%，AG-4占26.5%。Yang和Wu[11,12]分離甘肅、黑龍江和吉林黑痣病，分別得到融合群AG-4-HG-II，AG-5和AG-A。王宇[13]從內(nèi)蒙古和河北馬鈴薯黑痣病病樣分離得到AG-1-IB，AG-2-1， AG-3， AG-4-HG-I， AG-4-HG-II，AG-4-HG-III，AG-5，AG-9和AG-A共9個融合群。田曉燕等[14]從內(nèi)蒙古馬鈴薯黑痣病病樣中分離得到融合群AG-3占86.36%，AG-1-IB占2.27%，非融合類占11.36%。

近年來，隨著中國馬鈴薯面積的不斷擴大以及種植效益的不斷提高，重迎茬問題在馬鈴薯種植區(qū)較為普遍，由此導(dǎo)致馬鈴薯黑痣病普遍發(fā)生，且逐年加重[15,16]。據(jù)2015年內(nèi)蒙古中西部馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)調(diào)查，一般馬鈴薯田塊黑痣病發(fā)病率在30%～40%，嚴重的薯田發(fā)病率高達90%～100%。為了防止病害發(fā)生，種植者不斷加大化學(xué)藥劑施用量，不僅增加投入，更加劇對環(huán)境的污染，黑痣病已經(jīng)成為內(nèi)蒙古馬鈴薯產(chǎn)業(yè)發(fā)展的一大障礙。因此，本研究將針對內(nèi)蒙古中西部馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)開展黑痣病立枯絲核菌病原菌菌株分離、形態(tài)鑒定、病原菌生長速度測定、菌絲融合觀察及病原菌致病性等工作，以期明確內(nèi)蒙古中西部地區(qū)馬鈴薯黑痣病立枯絲核菌種內(nèi)分化情況、生長情況、融合群間致病力情況以及各地區(qū)融合群分布情況，為內(nèi)蒙古地區(qū)馬鈴薯黑痣病的抗病育種及病害有效防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

融合群5個標準菌株：AG-1-IA，AG-1-IB，AG-2-1，AG-2-IIIB和AG-3。

采集于內(nèi)蒙古中西部馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)120個不同地點的148份菌株。

1.2 馬鈴薯黑痣病立枯絲核菌病原菌的分離、純化和鑒定方法

從內(nèi)蒙古15個馬鈴薯主產(chǎn)旗縣的120個地區(qū)采集了馬鈴薯黑痣病典型癥狀的新鮮病害標本進行分離、純化、鑒定（菌株來源見表1）。從田間取回的帶有褐色潰瘍病斑的病莖或帶有棕褐色菌核的塊莖用流水沖洗，除去表面臟物，用手術(shù)刀取下潰瘍斑和健康莖部交界處的邊長0.5～0.7 cm的小方塊或菌核進行表面消毒，先放入75%的酒精中3～5 s，再放入0.1%HgCl2中浸泡2～3 min，取出用無菌水沖洗3～5遍，放在3層無菌濾紙上吸干水分，再放入PDA培養(yǎng)基中，每皿放入2～3個病塊或菌核，封口，放到25℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)48 h后，發(fā)現(xiàn)有菌絲長出，即在超凈工作臺無菌環(huán)境下，挑取菌絲尖端，移入PDA培養(yǎng)基中繼續(xù)純化培養(yǎng)，對疑似立枯絲核菌的菌株經(jīng)過鏡檢和形態(tài)學(xué)鑒定，確認為馬鈴薯黑痣病病原菌。鑒定為黑痣病的菌株合計148份保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 黑痣病菌株編號及采集地點Table 1 Rhizoctonia solani strains isolated from potatoes in different areas

1.3 馬鈴薯黑痣病立枯絲核菌病原菌生長速度測定

將保存?zhèn)溆玫鸟R鈴薯黑痣病立枯絲核菌菌株148個進行活化，活化后，在無菌的條件下，用打孔器打出直徑為5 mm的待測菌株菌餅，接種到直徑為90 mm的PDA培養(yǎng)基平板的正中央，每個菌株做3個重復(fù)，然后將培養(yǎng)皿放在溫度為25℃的培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)，記錄培養(yǎng)時間、測量菌落的直徑、計算生長速度。

1.4 馬鈴薯黑痣病立枯絲核菌融合群鑒定

選取具有地域代表性的馬鈴薯黑痣病（立枯絲核菌）病原菌61份，與已知融合群的標準菌株：AG-1-IA，AG-1-IB，AG-2-1，AG-2-IIIB和AG-3共5個菌株進行融合鑒定。

鑒定方法參照陳延熙等[17]玻片對峙法，本研究略加改進，將待測定的61份黑痣病菌株與5個標準菌株分別配對培養(yǎng)。具體方法如下：活化待測菌株與標準菌株，同時置于25℃恒溫箱黑暗培養(yǎng)48 h后，在菌落邊緣用打孔器取直徑5 mm的菌餅，將無菌載玻片上涂滿一薄層水瓊脂培養(yǎng)基凝固后，挑取標準菌株菌餅置于載玻片中央，再把同一個待測菌株的兩個菌餅分放兩側(cè)，與標準菌株相間1.5～2.0 cm，然后將載玻片放入無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，25℃黑暗恒溫培養(yǎng)36～48 h，重復(fù)試驗3次。待測定菌株與標準菌株的菌落前端生長相遇，觀察交疊至5 mm時，直接顯微鏡下鏡檢二者菌絲融合情況。

融合群的鑒定標準如下：

A.完全融合：接觸后細胞間細胞壁溶解，細胞質(zhì)融合，互有引誘現(xiàn)象，細胞質(zhì)、細胞核流入另一細胞內(nèi)，屬于同一菌株內(nèi)的菌絲融合。

B.不完全融合：接觸后細胞間細胞壁溶解，造成另一細胞發(fā)生畸形，原生質(zhì)減少或消失，細胞壁溶解后死亡，屬于同一融合群內(nèi)不同菌株間融合。

C.完全不融合：接觸后細胞壁不融合，沒有異常反應(yīng)，各菌絲按原來方向繼續(xù)生長，互不干擾，屬于不同菌絲融合。

1.5 不同融合群立枯絲核菌致病力的測定

選取具有地域代表性的生長速度不同、融合群種類不同的9個菌株進行致病力測定（表2），寄主為馬鈴薯，品種為‘克新1號’原原種。測定方法：將選用的菌株分別培養(yǎng)在PDA平板培養(yǎng)基上，25℃恒溫條件下培養(yǎng)15 d，每個菌株培養(yǎng)3皿，作為接種體。采用盆栽種植馬鈴薯，接菌采用土壤拌菌法，3 kg高溫滅菌土壤與培養(yǎng)好的3皿菌株均勻攪拌后放入營養(yǎng)缽，‘克新1號’原原種用0.5%的高錳酸鉀表面消毒10 min，每盆5粒原原種，播種深度10 cm，另用不接菌作對照，每個處理4次重復(fù)。培養(yǎng)期間定期定量加水保持土壤濕度，溫室內(nèi)培養(yǎng)，溫度控制在18～28℃，生長90 d后，根據(jù)曹春梅等[18]和張春艷等[19]的病情分級標準，調(diào)查發(fā)病情況，計算病情指數(shù)。試驗過程中除了菌種以外其他條件均保持一致。

黑痣病薯塊分級標準如下：

0：無病斑；

1：病斑小，病部面積占整個薯塊面積的5%以下；

3：病斑較小，病部面積占整個薯塊面積的5%～10%；

5：病斑較小或個別較大，病斑面積占整個薯塊的11%～25%；

7：病斑大小均有分布，病斑面積占整個薯塊面積的26%～50%；

9：病斑大小均有分布，病部面積相連占整個薯塊面積的51%以上。

病情指數(shù)=∑（各級病塊莖數(shù)×相對級數(shù)值/調(diào)查總塊莖數(shù)×9）×100

2 結(jié)果與分析

2.1 馬鈴薯黑痣病立枯絲核菌病原菌的分離、純化和鑒定

對從內(nèi)蒙古中西部地區(qū)采集到的148份馬鈴薯黑痣病病樣進行了分離鑒定，通過鏡檢、形態(tài)學(xué)測定，分離到的148份菌株均具有立枯絲核菌的分類特征：菌絲生長速度較快，不產(chǎn)生分生孢子，主枝與側(cè)枝呈直角或銳角，且分枝處有明顯縊縮現(xiàn)象，近分枝處有隔膜，菌絲細胞無鎖狀聯(lián)合等（圖1），因此將分離得到的菌株鑒定為立枯絲核菌。

表2 馬鈴薯黑痣病立枯絲核菌菌株Table 2 Selections of R.solani strains

圖1 供試菌株形態(tài)Figure 1 Morphologic traits of R.solani strain

2.2 馬鈴薯黑痣病立枯絲核菌病原菌生長速度

測定了148株馬鈴薯黑痣病立枯絲核菌病原菌在PDA上的生長速度（mm/h）。根據(jù)測定的菌株在PDA上平均生長速度，采用歐氏距離按非加權(quán)組平均法（UPGMA）進行菌株生長速度聚類分析，如圖2所示，148個菌株被劃分為生長速度慢、中等和快3種類型。其中病原菌生長速度為慢類型的菌株28株，占測定菌株的18.92%，菌株生長速度在0.180～0.400 mm/h，平均生長速度為0.333 mm/h；生長速度為中等類型的菌株58株，占測定菌株的39.19%，菌株生長速度在0.410～0.524 mm/h，平均生長速度為0.467 mm/h；生長速度為快類型的菌株62株，占測定菌株的41.89%，菌株生長速度在0.528～0.692 mm/h，平均生長速度為0.610 mm/h。結(jié)果表明，馬鈴薯黑痣病立枯絲核菌病原菌的生長速度是不同的，從內(nèi)蒙古中西部地區(qū)采集的黑痣病病原菌以中、快生長速度類型為主。

2.3 馬鈴薯黑痣病立枯絲核菌融合群

選用的61株馬鈴薯黑痣病立枯絲核菌菌株，與5株標準菌株分別進行菌絲融合群鑒定。鑒定結(jié)果，最終將61株立枯絲核菌菌株分為3個類群：AG-1-IB為4個，其中1株為不完全融合，其余3株完全融合，AG-1-IB融合群所占比例為6.56%；AG-3為45個，其中6株不完全融合，其余39株均為完全融合，AG-3所占比例較高為全部菌株的73.77%；AG-2為3個，都是不完全融合，占4.92%；非融合類9個（均不與5株標準菌株融合)，所占比例為14.75%。從測定的61株菌株結(jié)果得出，內(nèi)蒙古各地區(qū)的馬鈴薯黑痣病立枯絲核菌的優(yōu)勢融合群為AG-3。菌絲之間融合與否的具體表現(xiàn)如圖3、圖4、圖5所示。

2.4 不同融合群立枯絲核菌致病力

接種供試菌株90 d后，調(diào)查塊莖的病情指數(shù)。不同融合群的馬鈴薯黑痣病病原菌進行人工接種致病力測定，結(jié)果表明供試菌株都可侵染馬鈴薯，在馬鈴薯塊莖上出現(xiàn)典型的黑痣病癥狀，不接菌的對照無任何癥狀，但生長速度不同、融合群不同的病原菌菌株致病力強弱不同（表3），生長速度不同的病原菌，致病力出現(xiàn)明顯差異，編號84的菌株為快速生長型，侵染馬鈴薯的病情指數(shù)為55.56，為強致病菌株，編號44的菌株為慢速生長型，侵染馬鈴薯的病情指數(shù)為19.19，為弱致病菌株；同一生長速度類型的菌株，致病能力也不相同，出現(xiàn)明顯差異，在慢型中，編號112的菌株侵染馬鈴薯的病情指數(shù)為32.32，為中等致病菌株，編號44的菌株侵染馬鈴薯的病情指數(shù)為19.19，為弱致病菌株；不同融合群的病原菌，致病力不同，出現(xiàn)明顯差異，編號14的菌株，屬于AG-3融合群，侵染馬鈴薯的病情指數(shù)為28.91，為弱致病菌株，編號27的菌株，屬于AG-1-IB融合群，侵染馬鈴薯的病情指數(shù)為46.25，為強致病菌株；同一融合群的菌株，致病能力也不相同，出現(xiàn)明顯差異，同是AG-3融合群的編號為49和44的菌株，編號49的菌株侵染馬鈴薯的病情指數(shù)為32.03，為強致病菌株，編號為44的菌株侵染馬鈴薯的病情指數(shù)為19.19，為弱致病菌株。從試驗結(jié)果可以看出生長速度相同與不同、融合群相同與不同立枯絲核菌致病能力都是不相同的，存在顯著差異，表明內(nèi)蒙古各地區(qū)馬鈴薯黑痣病病原菌侵染能力的多樣性。

圖2 148株馬鈴薯黑痣病立枯絲核菌病原菌生長速度的歐氏距離非加權(quán)組平均法（UPGMA）聚類圖Figure 2 UPGMA using arithmetic means cluster of 148 Rhizoctonia solani strains,constructed with a Euclidean distance algorithm based on means of growth rate

圖3 完全融合Figure 3 Complete fusion of two mycelia

圖4 不完全融合Figure 4 Incomplete fusion of two mycelia

圖5 完全不融合Figure5 Non-fusion of two mycelia

2.5 馬鈴薯黑痣病立枯絲核菌菌株生長速度與致病力之間的關(guān)系

對內(nèi)蒙古中西部地區(qū)馬鈴薯黑痣病立枯絲核菌菌株的生長速度和致病力進行相關(guān)性分析，通過直線相關(guān)分析，得到擬合的直線相關(guān)方程為：Y=542.7X+8.759，Y代表菌株的病情指數(shù)，X代表菌絲生長速度，決定系數(shù)為0.286，說明菌絲的生長速度與致病力兩者之間存在一定正相關(guān)性（圖6）。從分析結(jié)果可見，菌株的致病力與其生長速度快慢存在一定的關(guān)系，除此之外還可能與菌株的其他因素有關(guān)。

表3 不同菌株致病力測定Table 3 Pathogenicity of different strains

圖6 馬鈴薯黑痣病立枯絲核菌菌絲生長速度與其致病力的相關(guān)分析Figure 6 Correlation analysis of Rhizoctonia solani growth rates and disease index

3討 論

本研究發(fā)現(xiàn)，在內(nèi)蒙古中西部地區(qū)采集到的148份馬鈴薯黑痣病立枯絲核菌各菌株生長速度不同，出現(xiàn)差異，根據(jù)生長速度進行聚類分析發(fā)現(xiàn)，可分成3類，快速生長型，中速生長型和慢速生長型。不同地區(qū)病原菌生長速度不同，在武川地區(qū)分離到的30個菌株，9個為快速生長型，13個為中速生長型，8個為慢速生長型，且發(fā)現(xiàn)不同生長速度，致病力不同，根據(jù)生長速度和致病力進行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)致病力與菌絲生長速度具有一定的正相關(guān)性。了解一個地區(qū)病原菌生長狀態(tài)的分布情況，對于預(yù)防和防治病害發(fā)生具有一定指導(dǎo)意義。

由于病樣標本的來源或發(fā)生地不同，馬鈴薯黑痣病病原菌種類構(gòu)成存在一定的差異性。本研究發(fā)現(xiàn)，在內(nèi)蒙古中西部地區(qū)采集的菌株存在融合群AG-1-IB，AG-2，和AG-3，其中AG-3出現(xiàn)頻率最高，占總數(shù)的73.77%，為優(yōu)勢融合群，融合群AG-1-IB占6.56%，融合群AG-2占4.92%，這與田曉燕等[14]報道內(nèi)蒙古黑痣病菌存在AG-3和AG-1-IB兩個融合群基本一致。但張春燕等[19]研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)蒙古地區(qū)馬鈴薯黑痣病菌中共存在8個融合群及亞群，分別為AG-1-IB，AG-2-1，AG-3， AG-4-HG-II， AG-4-HG-III， AG-5，AG-9及AG-A，其中AG-3，占77.06%，為優(yōu)勢菌群。在本研究中存在14.75%非融合群，不與標準菌株融合，可能屬于其他融合群，但本實驗室沒有相應(yīng)標準菌株，還需進一步研究。在國內(nèi)，Yang和Wu[20]、Yang等[21]報道，馬鈴薯黑痣病菌存在 AG-4-HG-II，AG-5，AG-A，AG-K，AG-F，AG-I和AG-U融合群。在國外，Woodhall等[22]報道英國存在AG-2-1，AG-3和AG-5融合群。Balali等[6]發(fā)現(xiàn)澳大利亞的黑痣病菌融合群為AG-3，AG-4和AG-5。Yanar等[7]在土耳其發(fā)現(xiàn)存在 AG-1，AG-2，AG-3，AG-5，AG-6，AG-8，AG-9，AG-10，AG-12和AG-13共10個融合群，其中AG-3占總數(shù)的83.9%，為優(yōu)勢融合群。國內(nèi)外研究均表明，馬鈴薯黑痣病菌融合群構(gòu)成多樣，但優(yōu)勢融合群仍為AG-3，本研究結(jié)果與其一致。在不同國家和地區(qū)，馬鈴薯黑痣病菌融合群存在不同，可能與地域環(huán)境或種植品種不同有關(guān)，具體原因需進一步研究。

馬鈴薯黑痣病立枯絲核菌不同融合群對馬鈴薯的致病力存在明顯差異。Yanar等[7]研究發(fā)現(xiàn)AG-3對馬鈴薯的致病力最強，其次是AG-4和AG-5，AG-2-1，AG-9和AG-1-IB最弱，而AG-A不致病。Chand和Logan[23]發(fā)現(xiàn)在北愛爾蘭的馬鈴薯上分離得到AG-3和AG-2-1融合群，并證明AG-3較AG-2-1有更強的致病性。EI Bakali等[24]首次報道在西班牙地區(qū)，AG-3融合群為該地區(qū)馬鈴薯黑痣病的主要致病類群。王宇[13]研究發(fā)現(xiàn)在內(nèi)蒙古和河北兩省分離的9個融合群中AG-3為主要致病群。本試驗將內(nèi)蒙古中西部地區(qū)馬鈴薯黑痣病立枯絲核菌分為AG-1-IB，AG-2和AG-3 3個融合群，其中AG-3為優(yōu)勢菌群，可能是引發(fā)黑痣病的主要菌群，這一點值得抗病育種專家加以重視。研究還發(fā)現(xiàn)同一融合群AG-3中的不同菌株的致病力不同，說明馬鈴薯黑痣病立枯絲核菌致病力發(fā)生分化。從達茂旗同一塊田地里分離到的菌株編號13和H29，分別屬于AG-3和AG-2，說明同一塊田里存在不同的立枯絲核菌融合群，反映了馬鈴薯黑痣病立枯絲核菌的多樣性、豐富性以及融合群間關(guān)系的復(fù)雜性，所以在生產(chǎn)中應(yīng)加強對馬鈴薯黑痣病菌不同融合群動態(tài)變化的監(jiān)測，才可有效預(yù)防和防治馬鈴薯黑痣病的發(fā)生。