荷移光度法測定谷物中嘌呤含量的實驗

劉曉庚 劉季敏 何詩雨 曹崇江 劉 琴周 彤 楊曉童 謝忠良 劉崇靖 汪若瑾

(南京財經大學食品科學與工程學院;江蘇省現代糧食流通與安全協同創新中心;江蘇高校糧油質量安全控制及深加工重點實驗室，南京 210023)

研究表明痛風及高尿酸血癥與飲食關系非常密切，且近年來這類患者逐年增加［1］;另外，通過限制富含嘌呤食物的攝入來預防痛風有良好效果［2－3］。在全球飲食結構不斷變革的今天，人們對膳食營養的需求也隨之改變，一些傳統的不良飲食習慣都在影響著人們的健康。目前有關食品中嘌呤含量的測定方法主要有紫外－可見光譜法［4］、紅外光 譜 法［5］、熒 光 光 譜 法［6－8］、高 效 液 相 色 譜法［9－12］、質譜法［13－14］、毛細管電泳法［15－19］和電化學法［20－21］等，而國內鮮見統一的食品中嘌呤含量測定方法［22］，因而無法在膳食方面提供有效的科學指導［23］。針對現階段最公認的嘌呤測定方法——HPLC法存在著操作過程比較繁瑣，使用試劑多，且有些還有毒或有害，對環境有污染等不足之處［24］;其他方法有的操作繁雜成本高、有的穩定性差達不到測定要求、有的適用范圍狹窄等。為此，在已探討的荷移光度法［25－29］的基礎上，用荷移光度法測定谷物中嘌呤化合物含量，旨在尋得一種綠色無污染、操作簡便、測定速度快又準確的谷物嘌呤測定新方法。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 材料與試劑

玉米、小麥、稻米(秈米、粳米、糙米)、稻殼、米糠、大豆均由江蘇省糧食局糧油質量監測所提供，小米、馬鈴薯、綠豆購自蘇果超市當年產無病害商品。

鳥嘌呤、腺嘌呤、黃嘌呤、次黃嘌呤、四氯對苯醌、氯醌酸、二甲亞砜(DMSO)，所用試劑均為分析純。

1.1.2 設備與儀器

Allegra 64R離心機(Beckman Coulter);RE52CS旋轉蒸發儀;KH－300DE型超聲波清洗器;UV－8000A型雙光束紫外/可見分光光度計;agilent1260高效液相色譜。

1.2 方法

1.2.1 標準儲備液配制

腺嘌呤、鳥嘌呤、次黃嘌呤和黃嘌呤分別用少量0.1 mol/L NaOH+水溶解后再用無水乙醇配成為1.00× 10－2mol·L－1的標準儲備液，再逐級稀釋成1.00 ×10－4mol·L－1標準使用溶液，備用。

1.2.2 樣品處理

按文獻［12］方法并作修改后對試樣處理，具體為:稱取2 g無病害干凈鮮樣品或0.4 g干樣品(均精確至0.1 mg)于研缽中，研碎后定量轉移至燒瓶中，加入10 mL 70%高氯酸，在沸水浴中進行回流水解45 min，冷卻后，用7 mol/L KOH中和至pH 7抽濾，濾液用1 mol/L磷酸調pH至3，再于3 500～4 000 r/min下離心15 min。清液于沸水浴上減壓旋蒸至干，再用無水乙醇超聲洗滌提取物4～5次，收集洗滌液以無水乙醇定容至50.0 mL，依次經G5砂芯漏斗和0.22μm膜過濾，將待測試液于0～4℃保存備用。

1.2.3 測定操作

取1.00 mL樣液于10 mL容量瓶中，加入1.00 mL 1 ×10－3mol·L－1氯醌酸乙醇液，搖勻，用無水乙醇定容，在一定溫度下反應一段時間后，再用1.0 cm的石英比色皿以試劑空白為參比，測得532 nm處吸光度值(ΔA)。

1.2.4 測定條件優化

用單因素考察法優化荷移劑種類、測定介質、酸度、荷移反應溫度、荷移反應時間和反應物配比。然后，與現行的HPLC法［11］進行對比。HPLC條件為色譜柱:Agilent XDB－C18柱(4.6 mm×250 mm，5.0μm);流動相:水－甲醇－冰乙酸－10%四丁基氫氧化銨(879/100/15/6);柱溫:30℃;流速:1.0 mL/min;進樣量:10.0μL;檢測波長:254 nm。

1.2.5 數據處理

實驗數據采用Excel 2010繪圖。Box－Behnken響應面設計實驗的多元回歸分析及方差分析均用Design－ Expert 8.0.6軟件處理。其他數據用SPSS17.0進行統計分析與處理，結果以“平均值±SD”表示。

2 結果與討論

2.1 荷移劑的選擇

在相同濃度下分別以氯醌酸、四氯對苯醌、茜素、茜素紅、苦味酸、對苯醌、2，4－二硝基苯酚和TCNQ(2，5－環己二烯－1a，4a－雙丙二腈或四氰代苯醌二甲叉)為荷移劑與鳥嘌呤按1.2.3操作方法進行反應，測得其反應后的UV－VIS(紫外可見光)吸收曲線(見圖1)。由圖1可知氯醌酸的荷移反應產物的UV－VIS吸收曲線最為理想，吸收曲線的穩定性和重現性均佳且λmax均為532 nm，為此選擇氯醌酸為荷移劑。為了求得嘌呤與氯醌酸荷移反應的關系，進一步實驗了四種嘌呤及其混合物分別與氯醌酸反應后UV－VIS吸收曲線(見圖2)。從圖2可見，這幾種嘌呤及其混合物均能與氯醌酸發生荷移反應形成良好的UV－VIS吸收曲線，盡管單獨嘌呤的荷移吸收峰位置和吸收強度稍有差異，但是它們的混合物表現出了極好的吸收曲線，而且混合物吸收峰與鳥嘌呤的峰存在極佳的相關性，這為用氯醌酸荷移光度法測定嘌呤奠定了客觀基礎。故選擇氯醌酸為荷移劑，且通過以鳥嘌呤為代表來考察并確定有關荷移光度法的測定條件。

圖1 不同荷移劑與鳥嘌呤反應的吸收光譜

圖2 四種嘌呤及其混合物與氯醌酸反應的吸收曲線

2.2 測定介質的確定

荷移反應的介質一般選用非水介質，故分別對常用無水乙醇、甲醇、乙腈作為介質按照實驗1.2.3操作方法，在其他條件不變，測定其吸收曲線(見圖3)。由圖3可知，以無水乙醇作為介質最佳，所以后續實驗選用無水乙醇作為測定介質。

圖3 不同介質的影響

2.3 水分的影響

在其他條件不變下，調節體系的水分含量分別為 0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%、4.5%和5.0%按照實驗1.2.3操作方法，測得其吸收曲線(見圖4)。由圖4可知，體系水分在3.0%以內的ΔA532值基本恒定，所以測定中控制水分2.5%～3.0%。

圖4 反應體系水分量的影響

2.4 酸度及酸度調節劑的影響

按1.2.3操作方法，在其他條件不變，分別用磷酸、鹽酸和硝酸將體系pH均調至5～6，測得其吸收曲線(見圖5)。由圖5及實驗現象表明，加硝酸或鹽酸后，體系顏色由紫紅色變為了淺黃色，UV－VIS曲線在可見光區也無吸收峰，這可能是硝酸的氧化性及氮和氯的供電子作用所致，因此，不宜用硝酸或鹽酸調節酸度。故選擇磷酸為酸度調節劑。

在其他條件不變，按1.2.3操作方法分別用磷酸將pH調至5.0、6.0和用氫氧化鈉將pH調至8.0、9.0后分別測定其吸收曲線(見圖6)。由圖6可知，當pH＞7呈堿性時吸收峰消失，荷移反應受－OH的供電子作用而被完全破壞;而pH 5～6時吸收曲線差別較小且峰值大，pH 7(中性)時吸收曲線形狀有所改變但吸收峰值與pH 5～6時相一致。可見實驗中也可不額外加酸度調節劑，即在中性條件下直接測定即可。

圖5 不同酸度調節劑的影響

圖6 不同酸度(pH值)的影響

2.5 反應溫度的影響

在其他條件不變，按1.2.3操作方法，分別在10℃、20℃、30℃、40℃水浴中保溫反應20 min后，再在室溫下測得吸收曲線(見圖7)。從圖7可見，溫度對其荷移反應影響甚小，吸收曲線形狀幾乎不變，這也表明在此溫度范圍內該荷移反應機理相同;但升溫對ΔA532值略有增加且低溫增幅比高溫大得多，這可認為該反應為吸熱反應，且吸熱會隨溫度升高而略微增加。為方便操作故后續實驗選擇室溫(約25℃)下進行。

圖7 不同溫度的影響

圖8 不同反應時間的影響

2.6 反應時間的影響

在其他條件不變，按1.2.3操作方法，分別測定反應5、10、20、30、40、50 min 和1、2、3、6、20 h 時的吸收曲線(見圖8)。由圖8可知，反應時間從5～30 min內其ΔA532值和吸收曲線都幾乎不變，在3 h以前吸收曲線形狀無明顯變化;6 h和20 h的吸收曲線形狀呈現出無規律的變化，溶液顏色逐漸消失，20 h時顏色完全消失。在450 nm后也無吸收峰，但在360～450 nm呈現雜亂的吸收，這反映出該荷移絡合物的不穩定性和20 h時這種絡合物已完全解離。這樣的變化不會影響該方法用于分析測定的可行性，因為它給測定留出了足夠的穩定時間。因此，以選擇反應時間為5～30 min為宜，本實驗選用反應時間為8 min。

2.7 反應的化學計量確定

由于荷移反應是一步完成的反應，適合用平衡移動法［25］確定所形成絡合物的組成。因此在其他條件不變，按1.2.3操作方法只改變氯醌酸的用量進行測定，其結果如圖9所示。由圖9可知，吸光度隨氯醌酸用量的增加而升高，只是在達到穩定計量點前較計量點后稍許顯著升高。當氯醌酸用量與鳥嘌呤用量摩爾比達到1∶3時，特征吸收峰最為完美，且吸光度最大。故認為氯醌酸與鳥嘌呤能形成摩爾比1∶3的穩定絡合物。

圖9 氯醌酸與鳥嘌呤反應配比的影響

2.8 荷移反應的機理推測及反應的絡合常數與標準自由能

2.8.1 荷移反應的機理推測及反應模型

根據荷移反應的構效關系［8］可知，氯醌酸為平面型π電子接受體，而嘌呤分子中均有孤電子對可作為電子給予體，在乙醇溶液中鳥嘌呤分子與氯醌酸可形成n－π*或π－π*型類似夾心面包式荷移絡合物。基于測得其荷移絡合物組成配比為n氯醌酸∶n鳥嘌呤=1∶3，其荷移反應可表示為:

2.8.2 絡合常數與標準自由能

2.9 實際樣品的測定及其效果

2.9.1 標準曲線

分別取鳥嘌呤和混合總嘌呤的標準使用溶液0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL，按 1.2.3 測定操作方法進行標準曲線的測定，結果顯示鳥嘌呤和混合總嘌呤的濃度在0～1×10－4mol·L－1范圍內有良好線性 關 系，且 其 線 性 方 程 分 別 為 ΔA鳥嘌呤=0.034c鳥嘌呤+0.005(R2=0.995 2)、ΔA總嘌呤=0.028 5c總嘌呤+0.007 1(R2=0.992)，其摩爾吸光系數分別為 ε鳥嘌呤=3.1 ×104L·mol－1·cm－1(這一結果與用Benesi－Hildebrand方程求算的結果相同，從另一個側面佐證了測定方法的可靠性)、ε總嘌呤=3.6×104L·mol－1·cm－1;其檢出限按信噪比 S/N=3［11］算得相對應的嘌呤濃度分別為 2×10－6mol·L－1、9×10－6mol·L－1。

2.9.2 實際樣品的測定與效果分析

按1.2.2的方法，先將試樣進行嘌呤提取，再將制得的嘌呤按1.2.3方法分別對實際樣品測得其ΔA532值，再根據標準工作曲線算得原樣中嘌呤含量，結果見表1。

表1 谷物及其制品中嘌呤含量測定結果(n=5)

從表1可知，實驗建立的方法有良好的精密度，其相對標準偏差(RSD)均小于8%。其中鳥嘌呤的RSD比總嘌呤的略大，原因是鳥嘌呤含量較低所致;另外，本法和HPLC法的RSD分別為2.2% ～7.3%、2.2%～7.5%，可見本法的精密度與HPLC法一致，這是兩種方法測定的穩定性相當且都有較高的結果。本法的回收率為 83.8% ～98.1% (平均91.9%)，與曲欣等［11］用 HPLC 法回收率達 91.8%相一致，符合微量組分分析要求。同時，經F－檢驗和t－檢驗也都表明本法與HPLC法無統計學上差異(P=0.05)。顯然本法利用氯醌酸與嘌呤的荷移反應光度的方法測定谷物中的嘌呤含量其精密度和準確性均與HPLC法相當，這也表明氯醌酸荷移光度法測定谷物中的嘌呤含量可行。

3 結論

以氯醌酸為荷移劑的光度法測定嘌呤含量的實驗得到其最優反應條件為:室溫(20～30℃)、pH中性、以無水乙醇為介質、控制測定體系水分2.5% ～3.0%、反應5 ～30 min，能得到 n氯醌酸∶n鳥嘌呤=1 ∶3的紫紅色穩定荷移絡合物;在λmax=532 nm下，鳥嘌呤和混合總嘌呤的濃度在0～1×10－4mol·L－1范圍內符合朗伯－比耳定律且有良好的線性關系，其線性方程分別為 ΔA鳥嘌呤=0.034c鳥嘌呤+0.005(R2=0.995 2)、ΔA總嘌呤=0.028 5c總嘌呤+0.007 1(R2=0.992)，其摩爾吸光系數分別為ε鳥嘌呤=3.1×104L·mol－1·cm－1、ε總嘌呤=3.6 ×104L·mol－1·cm－1，檢出限分別為 2 ×10－6mol·L－1、9 ×10－6mol·L－1。而對谷物實樣的測得結果顯示本實驗所建立方法有良好的精密度(RSD2.2% ～7.3%)且與HPLC法(RSD2.2% ～7.5%)相一致，回收率為83.8% ～98.1%與 HPLC法≥91.8%相當，符合 GB/T 27417—2017對微量成分分析的要求，獲得了滿意的結果。可見氯醌酸荷移光度法測定谷物中的嘌呤含量可行，而且本法易操作、速度快、成本低，是一種具有發展前景的測定食品嘌呤的方法。