固相合成比伐盧定的新方法

157013牡丹江友搏藥業有限責任公司

比伐盧定，英文名Bivalirudin，商品名Angiomax，由美國Medicines公司申請，于2000年12月經FDA批轉在美國上市，作為一種直接凝血酶抑制劑，它來源于水蛭素衍生物，是一種化學合成的含20個氨基酸的多肽，是凝血酶直接的、特異的、可逆性抑制劑，詳細序列為D-Phe-Pro-Arg-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-OH。早期的臨床研究顯示，比伐盧定抗凝療效確切，且出血事件的發生率較低，和傳統的肝素抗凝治療相比更為安全，對于接受經皮冠狀動脈介入治療(PCI)的患者，比伐盧定可用于替代肝素，并且隨著對比伐盧定臨床試驗的不斷研究，其在別的適應證方面亦表現出了不錯的治療效果，因此比伐盧定的未來應用前景極為廣闊[1]。關于比伐盧定的合成方法已有大量文獻報道，包括固相合成[2]、液相合成、固液相合成，而多數已報道的固相合成方法采用氨基酸逐個偶聯合成，周期長，逐步偶聯時樹脂反應難以完全，因固相載體選用的不同，主要有TCT樹脂及Wang樹脂[3-5]，其取代值的限制，總收率較低，同時雜質較多，且隨著反應進行，樹脂上的肽段變長，對于后上的活性較低的氨基酸，反應困難或不完全。而部分報道雖對上述方法有所改進，在逐個偶聯氨基酸中，部分肽段采用一次性接入的制備方法，但對于后續的其他氨基酸接入，對于氨基酸接入反應的難易度及完全度是一樣的，不會有改善。本研究采用兩個肽片段分別固相合成，每個片段的收率都很高，且接入點選擇Gly處，由于其活性強，且空間位阻小，使比伐盧定純度、總收率也很高，為以后的大量生產提供基礎。

材料與儀器

實驗材料：Fmoc-甘氨酸、Fmoc-N-三苯甲基-L-天冬酰胺、Fmoc-脯氨酸、Fmoc-2,2,4,6,7-五甲基二氫苯并呋喃-5-磺酰-L-精氨酸、Fmoc-亮氨酸、Fmoc-氧叔丁基-酪氨酸、Fmoc-氧叔丁基-谷氨酸、Fmoc-異亮氨酸、Fmoc-氧叔丁基-天冬氨酸、Fmoc-苯丙氨酸、Boc-D-苯丙氨酸、HATU、HOBT、2-氯三苯甲基氯樹脂(取代度0.5 mm/g)，均購于希施生物科技(上海)有限公司；CaH2購于西亞試劑；二氯甲烷、哌啶、N,N-二甲基甲酰胺、無水甲醇、冰乙酸均為分析純(AR)，購于北京化工廠；N,N-二異丙基乙胺為分析純，購于阿拉丁；三氟乙酸(TFA)為分析純，購于天津市大茂化學試劑廠；三異丙基硅烷、三氟乙醇均為分析純，購于北京百靈威科技有限公司；DIC為分析純，購于西亞試劑。

主要設備：高效液相色譜儀、Waters2996、PAD檢測器、Vydac 218TPTM C18柱(5 μm，4.6 mm × 250 mm)、XBridge TM、制備柱C18 OBDTM柱 (10 μm， 30 mm × 250 mm)、 Waters 3100質譜儀、分析天平、BSA2235，產自德國賽多利斯股份有限公司；循環真空泵SHZ-Ⅲ，產自上海亞榮生化儀器廠；旋片式真空泵，2XZ(S)-2，產自上海德英真空照明設備有限公司；旋轉蒸發器，RE-52AA，產自上海亞榮生化儀器廠；低溫冷卻水循環泵，CCA-20，產自鞏義市予華儀器有限責任公司；真空干燥箱，BZF-50，產自上海博訊實業有限公司醫療設備廠；高速冷凍離心機，3K15，產自北京五洲東方科技發展有限公司。

方法：⑴樹脂載樣：2-氯三苯甲基氯樹脂(Chemimpex，載樣量0.5 mmol/g，2 g)在 40 mL 無水 CH2Cl2中浸泡 30 min，除去溶劑，然后加入首個氨基酸Fmoc-亮氨酸0.7068 g(樹脂載樣量的2倍)、DIPEA 0.517 g(4倍)、二氯甲烷(40 mL)的溶液，緩慢攪拌1 h，再加入2 mL甲醇繼續攪拌15 min。除去溶劑，樹脂經二氯甲烷洗滌(20 mL×3次)。取20%哌啶-DMF溶液40 mL加入至⑴所得樹脂中，緩慢攪拌15 min以除去Fmoc保護基，然后經DMF(20 mL×3次)洗滌。⑵片段1偶聯：將Fmoc-N-三苯甲基-L-天冬酰胺 3.5802 g、 HATU 2.2815 g、DIPEA1.986 mL、DMF(30 mL)混合后形成的溶液加入上述樹脂中，緩慢攪拌，然后用DMF(30 mL×3次)洗滌，取20%哌啶-DMF溶液40 mL加入⑴所得樹脂中，緩慢攪拌15 min以除去Fmoc保護基，然后用經DMF(30 mL×3次)洗滌。然后順序接入Fmoc-甘氨酸1.7838 g、Fmoc-甘氨酸1.7838 g、Fmoc-甘氨酸1.7838 g、Fmoc-甘氨酸1.7838 g、Fmoc-脯氨酸2.0244 g、Fmoc-2,2,4,6,7-五甲基二氫苯并呋喃-5-磺酰-L-精氨酸3.8928 g、Fmoc-脯氨酸2.0244 g、Boc-D-苯丙氨酸1.5378 g，得到片段1樹脂。⑶氨基酸偶聯時間通過HPLC檢測，首先繪制每一個氨基酸的標準曲線，然后根據檢測反應液中未反應完的殘留氨基酸濃度，帶入標準曲線計算得到反應是否完全，然后確定反應時間，按氨基酸順序的偶聯反應時間如下：①Fmoc-N-三苯甲基-L-天冬酰胺1.5 h；②連續3次Fmoc-甘氨酸分別反應時間0.75 h；③再Fmoc-甘氨酸反應時間1.0 h；④Fmoc-脯氨酸1.5 h；⑤Fmoc-2,2,4,6,7-五甲基二氫苯并呋喃-5-磺酰-L-精氨酸2.0 h；⑥Fmoc-脯氨酸1.5 h；⑦Boc-D-苯丙氨酸1.5 h。載有片段1多肽的樹脂浸泡于二氯甲烷-三氟乙醇-冰乙酸溶液(8∶1∶1，v/v/v)50 mL中緩慢攪拌1 h混合物抽濾，濾液用水泵30℃水浴減壓濃縮，得到側鏈保護的粗品肽(片段1)。⑷片段2偶聯：按照2.2的方法，依次接入Fmoc-氧叔丁基-酪氨酸1.838 g、Fmoc-氧叔丁基-谷氨酸1.702 g、Fmoc-氧叔丁基-谷氨酸1.702 g、Fmoc-脯氨酸1.3496 g、Fmoc-異亮氨酸1.4136 g、Fmoc-氧叔丁基-谷氨酸1.702 g、Fmoc-氧叔丁基-谷氨酸1.702 g、Fmoc-苯丙氨酸1.5496 g、Fmoc-氧叔丁基-天冬氨酸1.646 g。按氨基酸順序的偶聯反應時間如下：①Fmoc-氧叔丁基-酪氨酸1.0 h；②Fmoc-氧叔丁基-谷氨酸1.5 h；③Fmoc-氧叔丁基-谷氨酸 1.0 h； ④Fmoc-脯氨酸1.5 h；⑤Fmoc-異亮氨酸1.5 h；⑥再兩次Fmoc-氧叔丁基-谷氨酸反應時間都是1.0 h；⑦Fmoc-苯丙氨酸1.5 h；⑧Fmoc-氧叔丁基-天冬氨酸1.5 h。⑸比伐盧定合成：片段1溶于50 mL無水DMF中，再加入DIC 0.47 mg、HOBT 0.405 g、干燥的片段2樹脂，緩慢攪拌12 h，過濾，樹脂經過DMF(20 mL×3次)洗滌，加入切割液三氟乙酸-三異丙基硅-水(95∶2.5∶2.5，v/v/v)40 mL中室溫攪拌2 h，過濾，濾液經40℃減壓濃縮得到粗品，加入60 mL冷乙醚白色懸浮物，離心后固體減壓干燥得到比伐盧定粗品，經過反相制備色譜制備純化，其純化方法：以十八烷基鍵合硅膠為固定相(YMC公司的Triart Prep C18-S)，色譜柱規格為250 mm×30 mm，粒徑10 μm，粒空隙12 nm。流動相A：0.1%三氟乙酸水溶液，流動相B：0.1%三氟乙酸乙腈溶液，檢測波長210 nm。

結 果

通過片段法合成得到的比伐盧定粗品純度及收率大大提高，因此制備純化后的比伐盧定純度甚至可以達到99.5%，該純度完全滿足國內外注射用比伐盧定的質量要求，粗品的HPLC圖，見圖1和圖2。

圖1 比伐盧定粗品HPLC圖

圖2 純化后比伐盧定 的HPLC圖

討 論

本研究采用兩個肽片段分別固相合成，每個片段的收率都很高，且接入點選擇Gly處，由于Gly活性較強，在采用傳統的20個氨基酸逐個偶聯的過程中，可能會產生2Gly、4Gly雜質的情況，造成最后制備純化困難，最終導致成品純度較低。而“10+10”片段法，在Gly處連接，由于其活性強，且空間位阻小，使反應順利進行，同時不良反應較少，能大大提高收率及純度。