β-地中海貧血患者82例基因型與臨床表型分析

翟英超 吳潔

571434海南博鰲一齡生命養護中心檢驗科，海南瓊海1

570100海南醫學院熱帶醫學與檢驗醫學院，海南海口2

β-地中海貧血屬于一種單基因遺傳疾病，在全世界具有較高的發病率，嚴重危害人們的身心健康，該病發病原因為β-珠蛋白肽鏈的合成減少或缺失、β-珠蛋白基因的缺陷，引起患者血紅蛋白的不穩定狀態以及紅細胞破壞后產生的以溶血性貧血為主的癥狀群，其臨床癥狀主要是不同程度的慢性進行性溶血性貧血[1]。我國β-地貧發生率較高的區域在長江以南各省，其中最為嚴重的省份為廣西、廣東以及海南等，海南人群的攜帶率估計約2.7%[2]，而海南黎族人群高達8%～11.6%[3]。當夫婦雙方均為地貧攜帶者時，就有可能出現由于基因缺失而導致的重癥地貧，甚至是妊娠晚期死胎或新生兒死亡。因此，重型地貧兒出生、優生優育的重要措施是篩查地貧，必要時孕婦需進行產前診斷。本文對海南β-地貧患者的基因突變類型、基因型和臨床表型進行了分析，以明確β-地貧患者的基因分布及其臨床特點，為β-地中海貧血篩查、診斷和防治提供依據。

資料與方法

選取2015-2016年收治β-地貧患者82例，男26例，女56例；年齡2個月～71歲。其中輕型48例、中間型15例和重型β-地貧19例。

檢測試劑和儀器：亞能生物技術有限公司提供的全血DNA快速提取試劑盒和β-地貧基因檢測試劑盒；全自動CD3700血細胞分析儀；韓國Finepcr Hybridization incubator combi-H12雜交儀；羅氏Cobas480型聚合酶鏈反應擴增儀；美國BIO-RAD variant高效液相色譜儀及配套試劑和質控物。

方法：⑴標本來源：收集β-地貧患者EDTA-K2抗凝全血1 mL，立即送檢作血常規和HPLC檢測，剩余標本-20℃保存備用。⑵血常規檢測：采用全自動血細胞分析儀對紅細胞有關數據(血紅蛋白含量、紅細胞計數、平均紅細胞血紅蛋白含量、平均紅細胞體積、紅細胞壓積以及紅細胞體積分布寬度)進行檢測，要求操作者嚴格按照操作說明書執行。⑶血紅蛋白亞型水平檢測：采用HPLC儀對血紅蛋白亞型HbA2及HbF含量進行檢測，要求嚴格按照儀器操作說明書執行。⑷β-地貧基因檢測：①全血DNA提取：基因組DNA的提取采用全血DNA快速提取試劑盒的操作說明書執行，DNA質量的鑒定提取采用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳法，設置電壓為4V/cm。②PCR擴增：β-地貧PCR反應體積25 μL，擴增條件為50℃15 min、95℃變性10 min、35個循環(94℃1 m→55℃30 s→72℃30 s)、72℃延伸5 min。每次均設陰性、陽性對照。③擴增產物分析：β-地貧常見18種突變類型的檢測方法：取β-地貧擴增產物25 μL，反向點雜交法(RDB)，要求嚴格按照試劑盒操作說明書執行。

統計學處理：直接計算概率。

結 果

β-地貧患者基因突變類型：82例患者中共檢出6種β-地貧基因突變類型，即 CD41-42(-TTCT)、IVS-Ⅱ-654(C→T)、-28(A→G)、CD17(A→T)、CD71-72(+A)及異常血紅蛋白βE。CD41-42(-TTCT)突變最為常見，其次是IVS-II-654(C→T)、-28(A→G)，其他類型較為少見，見表1。

β-地貧患者基因型及其表現型：82例β-地貧患者共有10種基因型，以41-42M/N最常見，其次是41-42M/M、654M/N；其對應表現型以β0雜合子所占比例最高(62.19%)，其次為β0純合子(23.17%)。

各臨床型β-地貧基因型：48例輕型β-地貧患者絕大多數基因型為β0/βN，少數為β+/βN；15例中間型β-地貧患者基因型較為復雜，大多也為β0/βN，其他還包括β+/β+、β0/β+及β0/βE；19例重型β-地貧患者基因型均為β0/β0。β0/βN患者既可表現為輕型，也可表現為中間型。

各臨床型β-地貧患者紅細胞參數和血紅蛋白亞型分析：紅細胞參數結果顯示82例β-地貧患者中表現為小細胞低色素性貧血者共67例(81.71%)；11例(13.42%)患者僅MCV、MCH降低，而無貧血；4例(4.88%)患者正常。輕型、中間型和重型β地貧患者中為小細胞低色素性貧血者所占比例分別為75%、80%和100%；β0雜合子和β+雜合子患者中各有76.47%和62.50%表現為小細胞低色素性貧血，其他表型均表現為小細胞低色素性貧血。

表1 β-地貧基因突變類型及突變頻率

討 論

本研究中82例β-地貧患者檢查顯示小細胞低色素性貧血占比81.71%，其中輕型、中間型以及重型占比分別為75%、80%和100%，可見大部分β-地貧患者可通過血細胞分析篩選出來[4]。近年來，HPLC被廣泛用于血紅蛋白亞型定量分析，研究顯示，除了靜止型，其他的地貧類型均可采用Hb亞型定量檢出，且其敏感性和特異性較高。我們發現經HPLC篩選的病例經基因檢測幾乎全部均為β-地貧，可見HPLC檢測Hb亞型含量對β-地貧有較高的診斷價值。本研究中大部分輕型β-地貧患者HbA2＞3.5%(79.17%)，而中間型僅有6例HbA2＞3.5%(40%)，中間型和重型地貧患者均以不同程度HbF增高為主。可見，紅細胞參數、Hb亞型分析對早期篩查β-地貧有重要價值，而將兩者聯合檢測則更為準確[5]。

海南作為地貧高發區，在人群中開展地貧篩查和遺傳咨詢、重視并加強產前診斷有助于防止重癥地貧患兒的出生。通過分析本地區常見β-地貧基因缺陷類型、基因型和表型、各臨床型β地貧基因型及其表型、β-地貧血液學特點，使我們更加了解海南β-地貧特征，并能更好的防治地貧。