淫羊藿苷預(yù)處理對(duì)急性肝損傷大鼠肝功能的保護(hù)作用及機(jī)制

金華，蔡克瑞，董建將，孫曉冬，閆磊

(1本溪市第六人民醫(yī)院，遼寧本溪117000；2牡丹江醫(yī)學(xué)院)

肝損傷是多種肝臟疾病發(fā)生、發(fā)展及最終走向肝功能衰竭的始動(dòng)環(huán)節(jié)和共同途徑，研究減輕肝損傷的方法具有重要的臨床意義。中藥淫羊藿具有溫陽(yáng)補(bǔ)腎、強(qiáng)筋健骨、祛風(fēng)除濕等功效，淫羊藿苷(ICA)是淫羊藿的主要活性成分，現(xiàn)代藥理研究證實(shí)，ICA具有抗腫瘤、增強(qiáng)免疫功能、改善心腦血管功能、抗氧化損傷、抗肝臟缺血再灌注損傷和抑制肝纖維化等多重藥理學(xué)作用[1]。有關(guān)ICA對(duì)急性肝損傷作用的研究少見報(bào)道。2016年11月～2017年6月，我們通過對(duì)急性肝損傷大鼠模型給予ICA預(yù)處理，觀察ICA對(duì)肝功能的保護(hù)作用，并探討其可能的機(jī)制，為防治肝損傷提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、試劑與儀器 SPF級(jí)大鼠40只，質(zhì)量300～400 g，雌雄不限。CCl4(廣州化學(xué)試劑廠)，ICA(陜西西安飛達(dá)生物技術(shù)有限公司)，超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程研究所)，腫瘤壞死因子α(TNF-α)、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)試劑盒(上海信帆生物技術(shù)公司)，TritonX-100、二甲基亞砜、胰蛋白酶(華舜生物工程有限公司)。Scout-Ⅱ半自動(dòng)生化分析儀，恒壓穩(wěn)流電泳儀，OLYMPUS熒光顯微鏡。

1.2 動(dòng)物分組與處理 將大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、ICA低劑量組和ICA高劑量組，每組各10只。ICA低劑量組給予腹腔注射ICA 30 mg/kg 2 mL，ICA高劑量組給予腹腔注射ICA 80 mg/kg 2 mL，對(duì)照組和模型組給予相同體積生理鹽水注射，均1次/d，連續(xù)7 d。末次給藥后2 h，模型組、ICA低劑量組和ICA高劑量組給予0.35% CCl410 mL/kg灌胃建立急性肝損傷模型，對(duì)照組給予相同體積生理鹽水灌胃。大鼠禁食不禁水，12 h后處死。

1.3 血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)檢測(cè) 大鼠處死后取股動(dòng)脈血，室溫靜置1 h，低溫離心10 min分離血清，-20 ℃保存?zhèn)溆谩２捎冒胱詣?dòng)生化分析儀檢測(cè)ALT、AST活性。

1.4 肝組織勻漿SOD、MDA、GSH-Px、TNF-α水平檢測(cè) 取大鼠肝臟全葉，液氮速凍后，-80 ℃保存。取適量?jī)龃娴母谓M織，加入液氮研磨，制備10%肝組織勻漿。采用考馬斯亮藍(lán)法檢測(cè)SOD、MDA、GSH-Px，ELISA法檢測(cè)TNF-α，嚴(yán)格按試劑盒說明書操作。

2 結(jié)果

2.1 各組血清ALT、AST水平比較 見表1。與對(duì)照組比較，模型組ALT、AST水平均升高(P均<0.01)；與模型組比較，ICA低劑量組、ICA高劑量組ALT、AST水平均降低(P均<0.01)。

表1 各組血清ALT、AST水平比較(U/L，x±s)

注：與對(duì)照組比較，*P<0.01；與模型組比較，△P<0.01。

2.2 各組肝組織勻漿SOD、MDA、GSH-Px、TNF-α水平比較 見表2。與對(duì)照組比較，模型組SOD、GSH-Px水平降低，MDA、TNF-α水平升高；與模型組比較，ICA低、高劑量組SOD、GSH-Px水平升高，MDA、TNF-α水平降低(P均<0.01)。

表2 各組肝組織勻漿SOD、MDA、GSH-Px、TNF-α水平比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.01；與模型組比較，△P<0.01。

3 討論

急性肝損傷是在短期內(nèi)由多種原因引起的肝功能突發(fā)性異常的疾病，其病因較多，機(jī)理復(fù)雜[2]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，急性肝損傷的發(fā)生與中毒、病毒性肝炎、免疫、血管障礙等相關(guān)，其機(jī)制可能與質(zhì)膜的完整性改變、線粒體功能失調(diào)、細(xì)胞內(nèi)離子濃度變化、自由基損傷增強(qiáng)和炎性因子表達(dá)增強(qiáng)等有關(guān)[3～6]。因此，對(duì)抗自由基損傷和降低炎癥因子表達(dá)或?qū)⒊蔀楸Ｗo(hù)急性肝損傷的新途徑。ICA是傳統(tǒng)中藥淫羊藿的有效藥理成分。最新的研究表明，ICA具有抑制肝癌[7]、對(duì)抗大鼠肝臟缺血再灌注損傷[8]、增強(qiáng)免疫和抑制肝纖維化[1]等作用，因此ICA在肝臟領(lǐng)域具有廣闊的研究前景。

SOD和GSH-Px是機(jī)體內(nèi)清除自由基的重要抗氧化酶，其活性高低可反映機(jī)體抗氧化能力[9，10]。SOD在全身各組織廣泛分布，可以與O2-反應(yīng)形成H2O2，H2O2經(jīng)過過氧化物酶和GSH-Px的催化生成水，從而清除自由基，保護(hù)細(xì)胞免受氧化性傷害。MDA是不飽和脂肪酸過氧化作用的終產(chǎn)物，可嚴(yán)重破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細(xì)胞腫脹、壞死、肝細(xì)胞膜通透性增加，造成肝細(xì)胞損傷[11～13]；MDA還可以使胞質(zhì)、膜蛋白及某些酶交聯(lián)蛋白復(fù)合物，刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體，介導(dǎo)免疫損傷[14]。MDA含量可以間接反映細(xì)胞受自由基損害和過氧化的程度。ALT、AST是肝細(xì)胞內(nèi)主要酶系，在肝細(xì)胞膜受損時(shí)，胞內(nèi)ALT、AST釋放增加，ALT、AST活性檢測(cè)是判斷肝細(xì)胞膜損傷最直接的指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示，ICA預(yù)處理可以使急性肝損傷模型大鼠血清ALT、AST活性降低，肝組織中SOD、GSH-Px活性增高，MDA含量降低。提示ICA可以增強(qiáng)急性肝損傷模型大鼠對(duì)抗自由基和抗氧化的能力，減少肝細(xì)胞損傷，保護(hù)肝細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能。

TNF-α是引起肝細(xì)胞嚴(yán)重壞死的重要介質(zhì)，TNF-α激活可以介導(dǎo)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞以及炎癥遞質(zhì)等的表達(dá)，加重肝細(xì)胞損傷，在肝損傷中起著核心作用[15]。本研究結(jié)果顯示，ICA可以使急性肝損傷模型大鼠肝組織TNF-α含量降低，提示ICA預(yù)處理可以降低急性肝損傷模型大鼠肝細(xì)胞炎性因子表達(dá)，減輕炎癥反應(yīng)，保護(hù)肝細(xì)胞功能。

綜上所述，ICA預(yù)處理對(duì)急性肝損傷大鼠的肝功能具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與降低ALT、AST活性，增加SOD、GSH-Px活性，降低MDA、TNF-α含量，減少自由基損害和減輕炎癥反應(yīng)有關(guān)。