不同嚴重程度急性胰腺炎患者血小板線粒體氧化功能比較

黃建剛，楊青，胡翠，馮慧，鮑峻峻，王兵兵，梅俏，許建明

(1安徽醫科大學第一附屬醫院，合肥230022；2馬鞍山市人民醫院)

急性胰腺炎(AP)是臨床常見的急重癥，有20%～30%的AP患者可發展成重癥急性胰腺炎(SAP)，引起多器官功能障礙，導致死亡[1]。全身炎癥反應(SIR)是AP多器官功能障礙發生發展過程中的關鍵環節。全身炎癥反應綜合征(SIRS)常見于膿毒癥、外傷、燒傷、急性胰腺炎等疾病[2]。線粒體功能障礙可抑制細胞能量生成及氧自由基的異常增多，導致細胞氧化損傷，擴大和加重炎癥反應過程,因此，線粒體在SIRS中發揮關鍵作用。研究表明，血小板中具有數量眾多的有功能的線粒體[3]，在AP過程中血小板功能會發生顯著變化[4]。超氧化物歧化酶(SOD)活性及谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性可反映機體血小板抗氧化能力，丙二醛(MDA)可反映機體血小板受自由基攻擊的嚴重程度。琥珀酸脫氫酶(SDH)和ATP酶均與線粒體氧化磷酸化有關。線粒體損傷時，因氧化磷酸化功能受到抑制，線粒體結構發生改變即線粒體腫脹度增加，影響線粒體正常功能。本研究通過檢測AP患者血小板中線粒體有關氧化損傷和能量代謝功能指標的變化，為AP病情評估和治療提供實驗依據。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2016年9月～2017年3月我院收治的AP患者40例，均符合急性胰腺炎診治指南(2014)制定的診斷和分類標準[5]，按病情嚴重程度分為輕癥急性胰腺炎(MAP)組25例、中度重癥急性胰腺炎(MSAP)組12例、SAP組3例。MAP組男15例、女10例，年齡(57.76±13.92)歲，APACHE-Ⅱ評分(3.24±2.71)分，BISAP評分(1.00±1.04)分，改良CT評分(2.48±0.87)分；MSAP組男9例、女3例，年齡(68.17±15.19)歲，APACHE-Ⅱ評分(6.58±2.50)分，BISAP評分(2.25±0.87)分，改良CT評分(3.00±1.04)分；SAP組男2例、女1例，年齡(66.67±12.09)歲，APACHE-Ⅱ評分(11.67±0.58)分，BISAP評分(6.00±5.19)分，改良CT評分(4.67±1.15)分。對照組為同期我院健康查體者9例，男4例、女5例，年齡20～50歲。各組性別、年齡具有可比性。本研究經安徽醫科大學第一附屬醫院倫理委員會批準，受試者均簽署知情同意書。

1.2 血小板的制備 AP患者于入院后24 h內、對照組空腹12 h后，采集空腹靜脈血10 mL，EDTA抗凝，4 ℃離心20 min，取上清即為富含血小板的血漿。將血漿4 ℃離心10 min，棄上清，所得沉淀即為血小板。加入與血漿等體積的生理鹽水將血小板重懸，室溫保存待測。

1.3 血小板SOD、MDA、GSH-Px、SDH、ATP酶水平檢測 采用BCA法。取適量血小板懸液，使用分光光度計(比色法)檢測GSH-Px、ATP酶、MDA、SDH水平，使用酶標儀(比色法)檢測SOD水平。試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，按試劑盒說明書操作。

1.4 血小板線粒體腫脹度檢測[6]取適量血小板懸液，按細胞線粒體提取試劑盒說明書提取線粒體。配制腫脹度測定液，腫脹度測定液1：蔗糖250 mmol/L，琥珀酸鹽3 mmol/L，KH2PO45 mmol/L；腫脹度測定液2：蔗糖250 mmol/L，琥珀酸鹽3 mmol/L，KH2PO45 mmol/L，CaCl20.3 mmol/L。將1 mg待測線粒體樣品與1 mL測定液1或2混勻，以參比杯調零。于25 ℃、0～10 min內連續測定線粒體樣品在520 nm處的吸光度A值。由于線粒體腫脹時，其吸光度在一定波長下降低，因此以吸光度A值的降低值表示線粒體腫脹度。

2 結果

2.1 各組血小板SOD、GSH-Px、MDA水平比較 與對照組比較，MAP組、MSAP組、SAP組MDA水平升高，SOD、GSH-Px水平降低；與MAP及MSAP組比較，SAP組血小板MDA水平增高，SOD、GSH-Px水平降低(P均<0.05)。見表1。

表1 不同程度AP患者血小板SOD、GSH-Px、MDA水平比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與SAP組比較，#P<0.05。

2.2 各組血小板ATP酶、SDH水平比較 與對照組比較，MSAP組、SAP組血小板ATP酶及SDH水平降低；與MSAP組比較，SAP組血小板ATP酶和SDH水平降低(P均<0.05)。見表2。

表2 不同程度AP患者血小板ATP酶、SDH水平比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與SAP組比較，#P<0.05。

2.3 各組血小板線粒體腫脹度比較 加入測定液后，對照組吸光度逐漸下降，MAP組吸光度下降幅度較對照組低，MSAP組吸光度下降幅度較MAP組低，SAP組吸光度下降幅度較MSAP組低(P均<0.05)。見表3、4。

表3 各組加入測定液1后血小板線粒體腫脹度比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與MAP組比較，#P<0.05；與MSAP組比較，☆P<0.05。

表4 各組加入測定液2后血小板線粒體腫脹度比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與MAP組比較，#P<0.05；與MSAP組比較，☆P<0.05。

3 討論

AP是由多種病因引起的胰酶激活，繼以胰腺局部炎癥反應為主要特征，研究表明，氧化應激與線粒體功能障礙參與了胰腺腺泡細胞損傷的過程[7]。線粒體的主要功能是通過氧化磷酸化產生細胞代謝必需的能量物質ATP。此外，線粒體介導氧自由基的產生和清除，線粒體是產生活性氧(ROS)的主要部位，當線粒體發生損傷時，氧應激被過度激活，活性氧合成增多，抑制線粒體的生物合成和穩態維持，損傷線粒體膜使膜電位下降，導致ATP生成減少及細胞內環境紊亂，最終導致細胞死亡。在雨蛙肽誘導的實驗性AP模型中，早期可出現胰腺腺泡上皮細胞的線粒體電子傳遞系統的功能障礙，胰腺線粒體合成ATP的能力下降，ROS水平明顯增高，ROS增高程度與AP嚴重程度有關[8]。因此，胰腺線粒體中異常增加的氧化反應或降低的抗氧化能力是AP發病機制的重要基礎。

盡管在AP的實驗模型中被證實存在線粒體功能的改變，但是在AP患者中獲得胰腺組織進行活檢來檢測線粒體功能很難實現且不符合倫理。因此，檢測外周血中的線粒體功能是了解AP患者機體線粒體功能的一種可行方法[9]。研究表明，血小板的線粒體功能障礙與膿毒血癥的臨床疾病活動度有關[10]。在膿毒血癥和心源性休克患者血小板中，線粒體呼吸功能受到抑制，ATP生成減少[11]。在連續流動左心室輔助裝置植入術后發生SIRS的患者中，血小板線粒體膜電位明顯升高，線粒體損傷嚴重[12]。SIRS是SAP病理生理過程中的關鍵環節，因此了解血小板中線粒體功能的變化對探討AP發病過程中炎癥損傷的機制具有重要意義。

氧化損傷是引起AP發病的重要因素，SOD和GSH-Px是機體內重要的抗氧化因子，通過抑制脂質過氧化反應，保護細胞膜的結構和功能完整。MDA是機體脂質過氧化產物之一，反映了機體脂質過氧化的程度。本研究結果顯示，與對照組比較，AP患者血小板中MDA水平升高，SOD和GSH-Px活性降低；SAP組MDA水平高于MAP組和MSAP組，SOD和GSH-Px活性低于MAP組和MSAP組。表明AP患者機體抗氧化能力受到抑制，氧化損傷作用增強，其中SAP患者氧化損傷作用增強及抗氧化作用抑制更明顯。

SDH是三羧酸循環的關鍵酶之一，參與細胞能量代謝，ATP酶可催化ATP分解為ADP釋放能量，均與線粒體氧化磷酸化及能量供應有關。本研究結果顯示，與對照組比較，AP患者血小板中SDH和ATP酶活性降低；SAP組SDH和ATP酶活性低于MAP組和MSAP組。表明AP患者氧化磷酸化及能量合成功能下降，其中SAP患者線粒體氧化磷酸化及能量合成功能抑制更明顯。線粒體是細胞能量合成場所，AP發病抑制線粒體功能，SDH及ATP酶活性降低，導致機體能量代謝紊亂，提示線粒體能量合成功能受損與疾病嚴重程度相關。

AP可導致線粒體腫脹、線粒體膜去極化。線粒體通透性轉換孔道開放引起的線粒體腫脹，吸光度在一定波長下減少。通過測定吸光值變化能夠反映線粒體的腫脹度。本研究結果顯示，與對照組比較，AP患者線粒體腫脹變化不明顯，提示線粒體因結構及功能遭受破壞，對外環境酸堿度及Ca2+的變化不敏感；其中SAP組線粒體腫脹下降明顯低于MSAP及MSAP患者血小板線粒體，提示SAP組血小板線粒體損傷更為明顯，導致對外環境酸堿度及Ca2+的變化更加不敏感。因此，SAP組血小板線粒體功能損傷較MAP組和MSAP組更嚴重。提示線粒體功能損傷程度與疾病嚴重程度相關。

綜上所述，AP患者血小板線粒體受到氧化損傷，能量合成功能受到抑制，SAP患者的受損程度更嚴重。