無(wú)創(chuàng)性免核酸提取的多重SNP基因分型技術(shù)

趙 燁，趙亞玲，周 軍，鄭 直

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院 生物化學(xué)與分子生物學(xué)系， 北京 100005)

單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms，SNP)被認(rèn)為是疾病易感性和藥物反應(yīng)的決定因素[1]，約有105個(gè)SNP分子標(biāo)記被用于基因功能及疾病相關(guān)性研究[2]。此類研究需要簡(jiǎn)單而低成本的方法來(lái)獲得大規(guī)模的核酸。當(dāng)前的樣品類型多源于血液，需要提取核酸。血液采集需要專業(yè)人員及特殊器材，還可能引起一些潛在的病源傳播。大量核酸提取費(fèi)時(shí)費(fèi)力，成本高不易開展。目前在大規(guī)模SNP基因分型上仍無(wú)一種可用于無(wú)創(chuàng)性樣品的高效簡(jiǎn)便的核酸獲取方式。故建立一種無(wú)創(chuàng)性且免核酸提取的多重SNP基因分型技術(shù)具有很大的應(yīng)用價(jià)值。

葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase, G6PD)缺乏癥的實(shí)質(zhì)是G6PD發(fā)生單堿基錯(cuò)義突變導(dǎo)致的酶活性降低[3]。瘧疾流行國(guó)家G6PD 缺乏癥發(fā)病率高達(dá)8%[4]，而抗瘧藥伯氨喹啉(primaquine)可誘發(fā)G6PD 缺乏癥患者發(fā)生溶血[5]。進(jìn)行G6PD突變型篩查可為伯氨喹啉的使用提供預(yù)先風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。本研究將以G6PD SNP檢測(cè)作為應(yīng)用對(duì)象，建立適用于無(wú)創(chuàng)性樣品免核酸提取的多重SNP基因分型技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品：包括來(lái)自健康受試者的的血液，唾液及口腔拭子，及來(lái)自中緬邊境7例間日瘧口腔拭子樣品。所有樣品均獲得倫理委員會(huì)審批及受試者知情同意。

1.1.2 主要試劑：唾液及口腔拭子DNA提取試劑盒、血液DNA提取試劑盒、蛋白酶K， T4 DNA ligase(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)；Spectro CHIP芯片和樹脂試劑盒、iPLEX Gold試劑盒(Agena Bioscienc公司)；T4多聚核苷酸激酶、T4 DNA polymerase、dNTP(New England Biolabs，NEB公司)；EasyTaq DNA polymerase (北京全式金生物技術(shù)有限公司)；牛血清白蛋白(北京鼎國(guó)昌盛生物有限公司)；裂解液(Affymetrix公司)；捕獲板、洗液(Diacutate公司)。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集：保證受試者在過(guò)去30 min內(nèi)沒有進(jìn)食，飲水，抽煙等。唾液采集之前用舌頭刮上下顎10～15次保證脫落細(xì)胞的數(shù)量，后將唾液收集于2 mL 離心管內(nèi)；收集口腔拭子時(shí)，持口腔采樣棉簽在內(nèi)壁黏膜旋轉(zhuǎn) 10～15 圈，然后再上下移動(dòng)刮拭5～10次，力度適中，以緊貼口腔內(nèi)壁黏膜為宜，確保拭子各處都能蘸取口腔黏膜脫落細(xì)胞，剪去拭子多余木棒部分，置于2 mL離心管內(nèi)。

1.2.2 G6PD序列以及23個(gè)SNP位點(diǎn)選取：采用G6PD的cDNA在GenBank中序列標(biāo)識(shí)符為X03674(version:X03674.1 GI:31542)，檢測(cè)中國(guó)人中最常見的G6PD的23個(gè)突變位點(diǎn)[6]。

1.2.3 無(wú)創(chuàng)性免提取核酸的多重SNP分型法：每100 μL裂解體系包括：裂解液33.3 μL(3X)、蛋白酶K 5 μL(20 mg/mL)，探針混合物1 μL(0.1 mmol/L)、反向通用引物2 μL(0.1 mmol/L)、樣品(18～58 μL唾液/一個(gè)口腔拭子)和去離子水，56 ℃劇烈搖動(dòng)30 min進(jìn)行裂解反應(yīng)。后將裂解產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至捕獲板中98 ℃加熱5 min后55 ℃過(guò)夜孵育完成捕獲反應(yīng)。結(jié)合基于延伸連接的多重探針擴(kuò)增(multiplex extension and ligation-based probe amplification,MELPA)技術(shù)[6]對(duì)模板進(jìn)行信號(hào)放大。最后進(jìn)行單堿基引物延伸及質(zhì)譜分析。質(zhì)譜數(shù)據(jù)利用MassARRAY?分子量陣列技術(shù)TyperAnalyzer軟件4.0版(Agena Bioscience公司)進(jìn)行分析。每次實(shí)驗(yàn)設(shè)4個(gè)樣品，每個(gè)樣品做3個(gè)重復(fù)對(duì)G6PD 23個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)。統(tǒng)計(jì)每個(gè)分型結(jié)果可信度等級(jí)，分為A、B、C和D級(jí)(A:conservative、 B:moderate、C:aggressive、 D:low probability)，可信度依次遞減[7]?？尚哦鹊燃?jí)為A，B或C表示SNP檢測(cè)獲得成功，成功率(call rate)表示所有樣品所有SNP成功檢測(cè)數(shù)占總檢測(cè)數(shù)的比例[8]。設(shè)流行病學(xué)研究中常用的標(biāo)準(zhǔn) 95%成功率為界限[9]。

1.2.4 商業(yè)化SNP檢測(cè)法iPLEX：iPLEX GOLD技術(shù)可以設(shè)計(jì)最多達(dá)40重PCR反應(yīng)和基因型檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)靈活，分型結(jié)果準(zhǔn)確。提取血液(200 μL/assay)基因組DNA。通過(guò)探針設(shè)計(jì)軟件2.0版(Agena Bioscience，San Diego，CA; https://www.agenacx.com)設(shè)計(jì)G6PD基因的23個(gè)突變檢測(cè)的多重iPLEX反應(yīng)引物，使用iPLEX市售試劑盒進(jìn)行測(cè)定。以MassARRAY Typer分析儀軟件版本4.0(Agena Bioscience)分析質(zhì)譜數(shù)據(jù)。

1.2.5 測(cè)序法檢測(cè)SNP：利用primer5軟件設(shè)計(jì)了覆蓋23個(gè)G6PD SNP位點(diǎn)序列的14條引物。提取樣品DNA，進(jìn)行總體積為50 μL的PCR反應(yīng)(0.4 μmol/L引物，25 μL Premix Taq，水和模板)。使用3730自動(dòng)測(cè)序儀(Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA)對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行Sanger測(cè)序。

1.2.6 方法評(píng)價(jià)：用本方法及市場(chǎng)上普遍使用的以血液為樣品的iPLEX技術(shù)對(duì)G6PD 23個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行3 d、4個(gè)樣品、3個(gè)重復(fù)共828個(gè)反應(yīng)的分型檢測(cè)，以測(cè)序法作為金標(biāo)準(zhǔn)比對(duì)。可靠性以結(jié)果可信度分別為A、B、C和D等級(jí)的檢測(cè)結(jié)果數(shù)占總檢測(cè)數(shù)的百分比來(lái)表示；重復(fù)性以3個(gè)重復(fù)孔分型結(jié)果均一致的檢測(cè)數(shù)占總檢測(cè)數(shù)的比例來(lái)表示；準(zhǔn)確性以與測(cè)序結(jié)果一致的檢測(cè)數(shù)占該位點(diǎn)總檢測(cè)數(shù)的比例來(lái)表示。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 無(wú)創(chuàng)免核酸提取的基因分型檢測(cè)方法

結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)對(duì)唾液與口腔咽拭子樣品SNP進(jìn)行高通量檢測(cè)，建立的無(wú)創(chuàng)免核酸提取方法可成功對(duì)G6PD的23個(gè)SNP進(jìn)行基因分型，成功率大于95%。

2.2 唾液樣品條件探索

2.2.1 反應(yīng)所需最低樣品量：當(dāng)樣品量大于18 μL時(shí)分型結(jié)果的成功率均為100%，盡管從這些樣品提取出的DNA含量波動(dòng)很大(±50.8 ng)。當(dāng)樣品量減少至10 μL時(shí)成功率則下降至95%以下。

2.2.2 樣品保存時(shí)間及保存方式：室溫保存至11周或-20 ℃保存4周的唾液樣品都可滿足實(shí)驗(yàn)要求，分型結(jié)果的成功率均大于99%。

2.3 方法的可靠性、重復(fù)性及準(zhǔn)確性評(píng)價(jià)

本方法低質(zhì)量分型結(jié)果(D:low probability)僅0.12%，以血液為樣品的iPLEX技術(shù)則為3.86%(圖1A)；在第2次重復(fù)測(cè)定時(shí)iPLEX與MELPA重復(fù)性有差異(P<0.01)(圖1B)；所有成功的分型結(jié)果中，本方法的分型結(jié)果都與測(cè)序結(jié)果相同。而iPLEX在159SNP位點(diǎn)上獲得正確的分型結(jié)果僅為52.8%，825位點(diǎn)則為0%(圖1C)。對(duì)比測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)iPLEX會(huì)提供錯(cuò)誤的雜合或半合子突變結(jié)果(表2，括號(hào)內(nèi)表示可信度等級(jí))。

2.4 在瘧疾流行區(qū)G6PD基因突變檢測(cè)中的應(yīng)用

篩查結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這7例患者的G6PD均為野生型無(wú)突變，服用伯氨喹啉后進(jìn)行定期隨訪亦未見該7例用藥的間日瘧患者發(fā)生溶血現(xiàn)象，即臨床表現(xiàn)符合本方法所得分型結(jié)果的基因表現(xiàn)型。

表1 唾液保存條件對(duì)分型結(jié)果的影響Table 1 Effect of saliva preservation conditions on genotyping results

A.call quality distribution; B.reproducibility of the genotype results for each assay on each day; C.genotyping call accuracy for the 23 G6PD SNP sites; *P<0.01 compared with MELPA in day 2

3 討論

本研究以無(wú)創(chuàng)性的唾液及口腔拭子為樣品，避免血液采集帶給受試者的不適感而拒絕采樣或者造成潛在病源傳播等缺陷；解決了基層大規(guī)模SNP篩查采樣時(shí)需要專業(yè)技術(shù)人員及特殊器材等問(wèn)題；對(duì)保存條件要求不高(表1)，便于儲(chǔ)存及運(yùn)輸。該法無(wú)需核酸提取，簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)操作、縮短了檢測(cè)時(shí)間、降低了檢測(cè)成本且在很大程度上解決了現(xiàn)有DNA提取技術(shù)中可能出現(xiàn)的樣品交叉污染，核酸質(zhì)量參差不齊等問(wèn)題。

實(shí)際操作中唾液收集效果不確定，導(dǎo)致從唾液中提取出的DNA 量有所區(qū)別，從而出現(xiàn)不同實(shí)驗(yàn)室或不同基因分型技術(shù)以唾液作為檢測(cè)樣品時(shí)所測(cè)得的結(jié)果及效果并不完全一致[10]。有時(shí)也因?yàn)闃悠氛滟F或者樣品量小而不能進(jìn)行DNA提取。而本方法無(wú)需提取核酸，避免了因DNA提取帶來(lái)的含量及質(zhì)量的差異，將唾液裂解后直接進(jìn)行檢測(cè)，經(jīng)過(guò)多次實(shí)驗(yàn)(表1, 圖1)，不同人不同時(shí)間及不同質(zhì)量的唾液樣品，20 μL的樣品量足以滿足實(shí)驗(yàn)要求。

相比于目前最為流行的商品化SNP分型檢測(cè)方法——以血液為樣品的iPLEX技術(shù)，本方法在可靠性、重復(fù)性方面的表現(xiàn)與之相當(dāng)甚至更優(yōu)，在準(zhǔn)確度上明顯高于iPLEX(圖1 )。iPLEX在159和825這2個(gè)位點(diǎn)的檢測(cè)上重復(fù)性較差，且會(huì)出現(xiàn)錯(cuò)誤結(jié)果(表2)。

在測(cè)試本方法臨床應(yīng)用的效果時(shí)，受試者均提供了口腔拭子樣品，該樣品采集后保存于離心管內(nèi)經(jīng)過(guò)郵寄到達(dá)北京進(jìn)行檢測(cè)，直至檢測(cè)時(shí)該樣品在室溫存放了3周，顯示口腔拭子樣品可長(zhǎng)期保存，對(duì)保存條件要求不高，并更易被受試者接受。

表2 兩種方法的差異結(jié)果Table 2 Discrepant results between two methods

本技術(shù)可成功進(jìn)行人群G6PD突變篩查，對(duì)瘧疾流行區(qū)的等位基因突變頻率及伯氨喹啉用藥風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估具有重要的意義。在精確醫(yī)學(xué)如靶向治療的藥物基因組學(xué)和突變檢測(cè)中，該方法將是一種大規(guī)模人群篩查的有用工具。