外界鐵濃度調控缺磷植物鐵吸收相關基因的表達量①

黃潔雪，閆明科，薛彩雯，沈仁芳，蘭 平*

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外界鐵濃度調控缺磷植物鐵吸收相關基因的表達量①

黃潔雪1,2，閆明科1,2，薛彩雯1,2，沈仁芳1，蘭 平1*

(1土壤與農業可持續發展國家重點實驗室(中國科學院南京土壤研究所)，南京 210008；2中國科學院大學，北京 100049)

磷和鐵都是植物必需營養元素，缺磷和缺鐵都會嚴重影響植物生長發育導致作物產量和品質下降。前期研究表明缺磷會導致植物鐵吸收基因的表達量下降，但這種下降與外界鐵濃度是否相關還不清楚。本文檢測了缺磷和正常磷條件下不同鐵濃度對植物鐵吸收基因的表達變化。結果顯示，缺磷導致植物主根生長受到顯著抑制，但該抑制現象和鐵濃度顯著相關，在鐵濃度下降到一定范圍后該抑制作用消失。qPCR結果顯示，缺磷顯著誘導缺磷響應基因、、表達量增加，且這種表達量增加僅受缺磷誘導，和鐵濃度無關。缺磷也顯著誘導鐵吸收相關基因、和的表達量下降，但這種下降具有明顯鐵濃度依賴性。隨著鐵濃度升高，缺磷誘導的鐵吸收基因的表達量下降幅度隨之增大，這可能是由于缺磷導致培養基中鐵的有效性增加所致。本研究結果為土壤磷、鐵肥料管理提供了新的視角。

缺磷；鐵吸收；磷鐵互作

磷和鐵都是植物必需營養元素，在結構組成和能量代謝過程中起著重要作用，礦質元素缺乏會嚴重影響油菜產量與品質[1]。在土壤溶液中，能夠被植物吸收的無機磷(Pi)通常會與鐵或其他土壤成分形成高度難溶的復合物而使其生物有效性降低。廣泛分布于我國南方地區的紅壤和磚紅壤，富含鐵、鋁氧化物，磷的生物有效性低，需要長期施肥以保持供磷水平[2-4]。而我國華北平原、黃河故道和西北黃土高原等地，其pH高達7.5 ~ 8.5，并富含游離碳酸鈣，因而缺鐵現象較為嚴重[5]，西南地區四川境內的石灰性紫色土也同樣缺鐵[6]。

植物為應對缺磷缺鐵，從形態、生理、代謝、分子等方面發生一系列變化[7-8]。擬南芥，雙子葉模式植物，與油菜同屬十字花科，近年來對它的研究十分深入詳實，為作物的實際生產利用提供理論基礎。擬南芥響應低磷可被分為系統反應和局部反應[9-10]。系統反應包括涉及整體增強磷吸收和體內磷利用效率的基因的表達量增加，且主要受控于主要調節子(phosphate starvation response 1，一個MYB轉錄因子)[11-12]。調控下游一系列磷響應標記基因的表達，例如(induced by phosphate starvation 1)，它編碼一個長非編碼RNA且特異地受缺磷強烈誘導[13]；，編碼含有一個SPX結構域的蛋白，負反饋調節磷信號；(phosphate transporter 1)家族中的;和;，編碼負責從根際吸收磷的主要轉運子[14-15]。局部反應主要指根構型的改變，例如主根生長受抑制[16]、側根密度增加[17]、根毛密度和長度增加等[18]。擬南芥采用策略Ⅰ(還原機制)來克服缺鐵環境，該機制包括酸化、還原和轉運3個步驟[19]。首先，H+-ATP酶外排質子到根際以降低土壤pH，增加Fe(Ⅲ) 溶解度。其次，鐵還原酶FRO2(ferric chelate reductase 2)將Fe(Ⅲ) 還原成Fe(Ⅱ)[20]。最后，Fe(Ⅱ) 通過轉運子IRT1(iron-regulated transporter 1)將鐵運入根中[21]。轉錄因子(FER-like iron deficie-n-cy-in-du-ced transcription factor)是鐵吸收的關鍵調節子，它從轉錄水平調控、(cytochrome P450, family 82, subfamily C, polypeptide 4)，以及從蛋白水平調節的表達[22]。

缺鐵性萎黃病發病程度與土壤中的磷狀況緊密相關[23-24]。缺磷會誘導大部分缺鐵響應基因表達量下降[25]，但是同時又會在體內積累更多鐵[26]。鐵蛋白基因的表達受調節，通過增加表達量以清除過多的鐵[27]，而擬南芥Col生態型缺磷誘導的主根生長受抑制又依賴于鐵的存在[28-30]。前期研究表明，當培養基中鐵濃度從40 μmol/L下降到5 μmol/L時，缺磷誘導鐵吸收相關基因的表達量下降幅度明顯受到抑制[31]，但這種抑制是否具有鐵濃度依賴性還不明確。本研究對缺磷和正常磷條件下不同鐵濃度對植物主根生長和鐵吸收基因的表達變化進行了探討，研究結果對厘清磷鐵互作的機理提供了認識，為合理施肥提供了依據。

1 材料與方法

1.1 植物材料與生長條件

本試驗材料為擬南芥()Col-0生態型，由本實驗室保存。光照培養箱的溫度為 (22±1)℃，16 h光照/8 h黑暗，濕度70%，光照強度為50 μmol/(m2·s)。正常固體培養基為Estelle和Somerville的ES培養基[32]，成分為：5 mmol/L KNO3，2 mmol/L MgSO4，2 mmol/L Ca (NO3)2，2.5 mmol/L KH2PO4，70 μmol/L H3BO3，14 μmol/L MnCl2，1 μmol/L ZnSO4，0.5 μmol/L CuSO4，10 μmol/L NaCl，0.2 μmol/L Na2MoO4，40 μmol/L Fe(III)-EDTA，4.7 mmol/L MES (2-嗎啉已磺酸)，1%(/)蔗糖，0.8%(/)瓊脂，pH 5.5。種子用70% 酒精浸泡3 min，再用0.5% (/)次氯酸鈉+0.5%(/) 吐溫40表面消毒10 min，然后用滅菌水清洗干凈(5次)，播種于9 cm培養基上，密封好，置4 ℃低溫避光保存2 d，然后放入光照箱中培養。

1.2 磷鐵處理對擬南芥主根生長的影響

待Col-0擬南芥正常生長5 d后，挑選長勢一致的幼苗移植于不同磷鐵濃度處理的10 cm方形培養基上豎直培養，處理9 d，主根伸長量= 處理后主根長-移苗時主根長。缺磷處理采用KCl代替KH2PO4，兩種磷水平分別為+P(2.5 mmol/L P)和-P(0 mmol/L P)，加入不同濃度的Fe(III)-EDTA，不加記為-Fe，共計13個處理，分別為：+P-Fe，-P-Fe，-P+1 μmol/L Fe，-P+5 μmol/LFe，-P+10 μmol/L Fe，-P+20 μmol/L Fe，-P+40 μmol/L Fe，-P+100 μmol/L Fe，+P+40 μmol/L Fe(對照)，+P+100 μmol/L Fe，+P+150 μmol/L Fe，+P+250 μmol/L Fe，+P+350 μmol/L Fe。每個處理12株苗。

1.3 磷鐵處理對磷鐵響應標記基因表達量的影響

待Col-0擬南芥正常生長10 d后，挑選長勢一致的苗移植于不同磷鐵濃度處理的培養基上生長3 d，處理如本文1.2節所述，仔細采集根部，取約50 mg鮮樣用液氮速凍后保存于–80 ℃待提取RNA。總RNA提取依據Trizol reagent(Invitrogen)說明書進行。1 μg總RNA被用于反轉錄(TaKaRa，含gDNA Eraser，Cat#RP047A)。cDNA經稀釋12倍后，取2 μl作為模板進入后續10 μl體系的實時熒光定量PCR檢測(quantitative real-time RT-PCR，qRT-PCR)。qRT- PCR采用SYBR Green Perfect mix(TaKaRa，Cat# RR420A)在Thermo PIKOREAL 96 Real-Time PCR System儀器上進行檢測，運行程序采用兩步法，95 ℃/5 s，60 ℃/30 s，40個循環，內參基因為(tubulin alpha-3，At5g19770)，3次重復。檢測缺磷響應標記基因、和，鐵吸收主要調控基因，以及受調控的、和。引物信息見表1。

表1 qRT-PCR引物

1.4 表達量統計與分析

基因表達量采用2-?=2-(Ct基因-內參)計算，顯著性差異通過比較-?進行計算。主根長和基因表達數據統計采用SAS軟件，多重比較為鄧肯法，不同字母表示5% 差異性。

2 結果

2.1 缺磷對擬南芥主根生長的影響

相比對照(+P+40 μmol/L Fe)，缺磷(-P+40 μmol/L Fe)能顯著抑制主根生長(圖1)。-P+20 μmol/L Fe和-P+100 μmol/L Fe處理與-P+40 μmol/L Fe抑制程度相同，而當鐵濃度下降到10 μmol/L時，抑制作用解除，5 μmol/L時，主根伸長量最長，而當鐵濃度繼續降低時，缺鐵表型開始顯現，主根伸長量開始減少(圖1)。這說明，缺磷抑制主根生長依賴于鐵濃度，若鐵濃度低于某一范圍則解除抑制。+P-Fe比-P-Fe主根長更短，可能是由于大量的磷與培養基上微量的鐵結合形成難以被植物利用的磷鐵沉淀，進一步加重了缺鐵表型。在磷充足的條件下，隨著鐵濃度上升到達350 μmol/L，擬南芥出現高鐵毒害表型，主根生長受到明顯抑制，這與缺磷(-P+40 μmol/L Fe)處理表型相似(圖1)。

(A．不同磷鐵濃度處理后的植株照片。標尺為1 cm；B. 主根伸長量的統計分析。圖中數值為平均值±SD (n = 12)。小寫字母不同表示處理間差異達到P<0.05顯著水平，下圖同)

2.2 缺磷標記基因對鐵濃度變化的響應

缺磷時，植物除了發生形態學變化的局部響應，還會迅速發生分子水平的系統響應以適應環境，其中磷饑餓響應基因(Pi-starvation-responsive，PSR)涉及磷的吸收、轉運、代謝、轉錄調控以及信號轉導等多個生物學過程。本研究選用了受主要調節子PHR1直接調控并參與Pi信號轉導的長非編碼RNA，它常作為標記基因用來檢驗植物體內是否缺磷，受缺磷強烈誘導并負反饋調節磷信號網絡的，以及實現磷吸收的根中主要磷轉運子作為缺磷響應標記基因。在本研究的13個處理中，和在所有缺磷處理中表達量顯著增加，這說明試驗條件設置與操作達到了預想的結果，而在相同缺磷條件下不同的鐵濃度處理間表達量與鐵濃度無相關性(圖2)。這說明這些缺磷標記基因僅響應缺磷，對鐵濃度變化不響應。

2.3 鐵吸收基因對缺磷和不同鐵濃度的響應

為了研究鐵吸收基因在缺磷條件下的受抑制是否與鐵濃度相關，我們利用qRT-PCR分析根中鐵吸收基因的表達水平。的表達量與對照(+P+40 μmol/L Fe)比，僅在培養基中不添加Fe-EDTA時表現出明顯增加，當缺磷且鐵濃度維持在5 ~ 100 μmol/L范圍內時，缺磷顯著降低表達量；-P-Fe與+P-Fe相比，也表現出缺磷誘導表達量下降(圖3A)。受FIT調控的鐵吸收基因、和的表達水平本身受缺鐵誘導，并隨鐵濃度下降而升高，受高鐵抑制(圖3 B ~ D)。它們的表達同樣受缺磷抑制，例如，的表達量在-P-Fe中比+P-Fe中表達下降57.7%，-P+40 μmol/L Fe比+P+40 μmol/L Fe表達下降76.0%，-P+100 μmol/L Fe比+P+100 μmol/L Fe表達下降93.8%(圖3E)，這3個鐵吸收基因都表現出鐵濃度越高，受缺磷抑制越嚴重，與鐵濃度呈現顯著相關性。

3 討論

缺磷抑制植物主根生長具有生存意義，因為磷在土壤中的濃度隨著深度下降，所以在低磷土壤中淺根系的基因型往往具有更高的磷吸收效率[33]。土壤中單獨缺磷和單獨缺鐵都會誘導主根變短[16,34]，而缺磷低鐵的生長基質中植物生長受限的情況減輕并導致了類似于磷充分的根表型，表明衰弱的主根生長并非是對低磷的適應而是受到鐵毒害，因為磷缺乏條件下鐵具有更高的有效性[28]。在本試驗中，缺磷處理時，鐵濃度在20 ~ 100 μmol/L時都能抑制主根生長，而當鐵濃度低至10 μmol/L時抑制作用解除(圖1)，說明外界鐵濃度低于某一范圍后根尖積累的鐵不足以引起鐵毒。缺磷主根生長受抑制不僅取決于外界鐵的總濃度，還需要植物將鐵精確地沉積在干細胞龕以及在伸長區皮層細胞的質外體中[35]。缺磷且鐵濃度在20 ~ 100 μmol/L范圍時，主根伸長量一致(圖1)，可能的解釋是鐵定位于根尖質外體需要轉運子的協助，此時的限制因子在于轉運子數量而非外界鐵濃度。磷充分高鐵處理中，當鐵濃度達350 μmol/L時，引起明顯的鐵中毒現象，此時主根伸長量與缺磷(-P+40 μmol/L Fe)處理一致(圖1)，可能在根尖積累的鐵濃度與缺磷造成的鐵中毒相當。

在磷饑餓反應中，鐵濃度升高，鐵吸收基因表達量下降以及鐵清除蛋白的表達增加構成了穩健的鐵反應模式[36-38]。大量的研究發現缺磷時會抑制鐵吸收基因表達[25,31,38]，而當鐵濃度從40 μmol/L下降到5 μmol/L時[31]，該抑制作用減弱。鐵吸收基因是否直接響應植物磷含量變化，又或植物缺磷程度依賴于鐵濃度？已知缺磷系統響應依賴于體內磷狀態，局部響應依賴于外界磷濃度[9-10]。本研究設置的13種磷鐵濃度組合中，缺磷響應基因量、、只受缺磷誘導增加，與鐵濃度無相關性(圖2)，但是可以改變缺磷局部響應-抑制主根生長(圖1)。類似的試驗處理也發現葉片中的總磷含量僅與培養基是否缺磷相關，而與鐵濃度無關[26]。總之，鐵濃度不影響磷吸收但能抑制主根生長促使植物形成淺根系探索富磷表層土。農業生產中，施用化肥不僅能夠滿足植物生長所需營養，還可通過合理配比各元素含量調控根系結構，以達到減施增效的目的。

(A.FIT；B.IRT1；C.FRO2；D.CYP82C4；E.同一鐵濃度時磷充分與缺磷處理的相對表達量(%) = -P/+P×100%)

缺磷抑制鐵吸收基因表達可能是磷缺乏植物中鐵濃度升高的反饋調節[25]，也可能是P-Fe復合物無法形成，使得鐵有效性升高[26,28]。植物能靈敏地感知外界鐵濃度從而調節鐵吸收基因表達水平。在保持磷水平一致時，考察鐵吸收基因表達水平在不同鐵濃度處理中的變化，結果發現鐵吸收基因、和的表達水平與外界鐵濃度呈反比(圖3B ~ D)。而鐵吸收主要調節子只在完全不加Fe-EDTA時，表達量才相比對照增加(圖3A)，這是因為的表達受轉錄后嚴格調控，可以依據實時條件在很窄的范圍內微調有活性的FIT蛋白的數量[39-42]。鐵濃度梯度試驗有力地證明了植物能依據外界鐵濃度非常經濟高效地調控鐵吸收基因轉錄水平。鐵吸收基因在缺磷時表達量下降，該現象在本研究涉及的、、和中都能觀察到，有趣的是，這種下降與鐵濃度顯著相關，鐵濃度越高，下降幅度越大(圖3E)。這可能是因為缺磷處理后，大量的鐵不再與磷結合形成難溶的磷鐵復合物，鐵濃度越高則有效鐵越高，使得鐵吸收基因表達進一步下降，最終表現為缺磷引起的鐵基因表達量下降程度隨鐵濃度上升而加大。

缺磷時植物體內鐵含量增加，而鐵吸收基因如的表達量卻是顯著下降的，暗示了鐵并非通過常規的鐵吸收途徑進入植物。有研究表明，磷缺乏時突變體植株表現出類似于野生型在主根生長和鐵吸收方面的表型，即鐵的積累不依賴于的功能[38]。另一方面，缺鐵導致的主根短是受赤霉素調節的DELLA生長抑制子的空間分布控制的。缺鐵時，赤霉素含量下降，DELLA積累在分生區和伸長區，抑制主根伸長；另外缺鐵使得已分化區表皮細胞中不含有DELLA，解除了DELLA對FIT的互作和干擾，使得FIT能調控下游缺鐵基因的表達，促進鐵吸收[41]。缺磷也會降低GA含量積累DELLA從而抑制主根生長[43]。根尖是植物感受缺磷的部位[44]，缺磷時鐵和胼胝質沉淀在分生區和伸長區[35]，而FIT調控的鐵吸收機制在分生區和伸長區以外，因此FIT調控不太可能在根尖上協調對缺磷響應[41]。那么磷缺乏時鐵通過怎樣的路徑被植物吸收？有研究表明，七葉亭，一種高親和Fe3+-的香豆素，缺鐵缺磷時分泌量增加，且獨立于IRT1[45-46]，這可能部分解釋了缺磷時的鐵積累。植物可能存在一套在缺磷時積累鐵且相對于FIT獨立的鐵吸收系統[47]。進一步表明，FIT調控的鐵吸收基因在缺磷時表達量下降，是受外界環境鐵有效性升高影響而非響應磷濃度變化。

磷充分時，、、的表達隨鐵濃度上升(40 ~ 350 μmol/L Fe)而受到反饋抑制，表達量下降幅度緩慢。磷缺乏時，隨著缺鐵程度減輕(0 ~ 100 μmol/L Fe)，其表達迅速下降。過量施肥可能比施肥不足更加挑戰植物的自適應性。-P+10 μmol/L Fe處理中，這3個基因的表達量幾乎與對照+P+40 μmol/L Fe一致，由此推測，培養基中大量磷的存在，導致40 μmol/L Fe的加入實際只有10 μmol/L Fe的有效性。本試驗通過模擬土壤中磷鐵的互作，提示生產實踐中缺鐵土壤磷肥鐵肥的施用量需著重考慮實際有效性。已有研究發現，在石灰性水稻土中采用co-situs技術在水稻根際處施用含有氮磷鉀和微量元素的控釋肥能有效解除缺鐵造成的水稻減產甚至死亡，控釋肥顆粒與根系的接觸能增加利用率[48]。總之，磷鐵互作的機理還需要更深入的研究，以便于更好地指導施肥并為高效品種的選育提供理論基礎。

4 結論

綜上所述，缺磷局部響應中的主根生長受環境中鐵的濃度調節，缺磷響應標記基因、和僅響應磷濃度而不響應鐵濃度表明鐵濃度不影響植物對磷的吸收，缺磷抑制鐵吸收基因、和表達且抑制程度與外界鐵濃度正相關是由于環境中鐵有效性的改變，磷濃度能夠顯著影響植物對鐵的吸收。該結論提示磷肥減施控施時需要確保土壤中含有適量的鐵以形成有利于探索富磷表土的淺根系，鐵肥磷肥施用時更應考慮磷鐵難溶物對鐵肥生物有效性的影響。本文通過研究缺磷對鐵吸收基因的影響，為科學施肥以達成減施增效提供了新的視角。

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Phosphate Deficiency Induced Down-regulation of Iron Acquisition Genes is Dependent on Ambient Iron Concentrations

HUANG Jiexue1,2, YAN Mingke1,2, XUE Caiwen1,2, SHEN Renfang1, LAN Ping1*

(1 State Key Laboratory of Soil and Sustainable Agriculture, Institute of Soil Science, Chinese Academy of Sciences, Nanjing 210008, China; 2 University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China)

Phosphorus (P) and iron (Fe) are two essential nutrients for plants, and their low availability in soil would seriously constrain crop growth and development, leading to compromised yield and quality. The down-regulation of genes involved in Fe uptake in phosphate (Pi)-deficiency were reported previously, but it is unclear whether there is a dependency on Fe concentration contributing to the disturbance. In this research, the variation of the transcript abundance of Fe acquisition genes upon Pi-deficiency with different concentrations of Fe was analyzed. Results showed that the pronounced inhibition of primary root growth under Pi-deficiency was significantly correlated to Fe concentrations, and the inhibition disappeared when Fe concentrations were decreased to a certain range. qRT-PCR analysis showed that the expression levels of Pi-deficiency marker genes,,were dramatically and exclusively induced by P-deficiency, which is independent of Fe concentrations. The expression levels of Fe-deficiency marker genes,andwere significantly down-regulated by Pi-deficiency in a Fe-concentration-dependent manner, and decreased with increasing Fe concentrations, which might due to the elevated Fe availability in Pi-deficiency media. The results proposed a new perspective for management of P and Fe fertilizers in soil.

Phosphate-deficiency; Iron uptake; Interaction between phosphate and iron

國家重點研發計劃項目(2016YFD0200308)，國家重點基礎研究發展計劃(973計劃)項目(2015CB150501)和中科院南京土壤研究所135領域前沿項目(ISSASIP1605)資助。

(plan@issas.ac.cn)

黃潔雪(1986—)，女，貴州安順人，博士研究生，研究方向為植物缺磷響應分子機制。E-mail: huangjiexue-8612@163.com

10.13758/j.cnki.tr.2018.05.002

Q945.12

A