一株高效解鉀脫硅真菌的篩選、鑒定及培養條件優化①

張紅芳，何 剛，吳綠英，孫德四，陳 曄

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一株高效解鉀脫硅真菌的篩選、鑒定及培養條件優化①

張紅芳，何 剛，吳綠英，孫德四，陳 曄*

(九江學院藥學與生命科學學院，江西九江 332000)

為挖掘植物內生真菌功能活性菌株資源，從鉀礦區優勢蕨類植物——烏蕨()中篩選得到一株高效解鉀脫硅菌株WJ007。通過形態學特征觀察、rDNA ITS序列分析以及系統發育關系比較等研究，確定該菌株為小刺青霉。通過單因素試驗與正交試驗對WJ007菌株解鉀、脫硅培養條件進行優化，結果顯示：WJ007菌株脫硅最優培養條件為葡萄糖作碳源、酵母膏作氮源、碳氮比60∶1、初始pH 6，在該條件下培養液中可溶性硅含量為8.74 mg/L；WJ007菌株解鉀最優培養條件為葡萄糖作碳源、蛋白胨作氮源、碳氮比60∶1、初始pH 7，在該條件下培養液中可溶性鉀含量為154.44 mg/L。通過對WJ007菌株解鉀脫硅發酵條件的優化，可為植物內生真菌資源開發利用提供依據。

內生真菌；解鉀；脫硅；篩選；鑒定；培養條件

含鉀礦物中的鉀、硅元素是植物生長發育過程中不可或缺的大量營養元素，在植物生理代謝過程中起著非常重要的作用。我國能被植物直接吸收利用的可溶性鉀資源十分匱乏，但含鉀巖石以及土壤中的含鉀礦物顆粒十分豐富，這些含鉀礦物絕大多數是以難溶性含鉀硅鋁酸鹽存在，不能被植物直接吸收利用，如何從這些富含鉀、硅的難溶性硅酸鹽礦物中溶出可溶性的鉀、硅元素供植物吸收利用，是永恒的科學問題[1-2]。目前針對不溶性鉀礦資源制取鉀肥的方法大體分為高溫法和濕法，這些方法存在耗能大、嚴重污染環境等問題，而利用微生物法制取鉀肥，生產成本低，無污染，耗能低，有利于實現大規模的工業化生產[3]。

國內外學者在高效解鉀脫硅菌株篩選、活力測定、作用機制和優良菌株的選育等方面進行了廣泛研究，但這些鉀細菌在浸取鉀礦過程中仍然存在菌株不穩定、解鉀脫硅效應不理想等問題[4-7]，因此篩選出具有解鉀脫硅作用高效穩定的優質菌株及進行條件優化仍是該領域的研究熱點問題。

植物內生真菌作為一類特殊的微生物資源，與宿主植物形成互惠共生關系，可從植物中獲得足夠的碳源、氮源，且受到植物組織的良好保護，在幫助植物分解土壤礦物、攝取營養、抗病及促進植物生長等方面發揮重要作用[8-10]。國內外學者既開展了從土壤、植物根際、鉀礦區等生境中的解鉀菌株分離純化的研究，也開展了有關解鉀效應、解鉀機理等方面的研究，已取得了豐碩成果，但有關從植物體內篩選解鉀真菌的研究至今鮮見報道。因此，本試驗以分離自鉀礦區優勢蕨類植物——烏蕨()內生真菌的菌株為研究對象，通過平板活性測定試驗分離篩選出高效解鉀脫硅活性菌株，并對其進行鑒定，同時進行培養條件優化，這不僅可增加解鉀脫硅菌株資源，而且可為進一步研究植物-微生物共生體在植物礦質營養與逆境生理中的作用機理提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 供試菌株為從龍南鉀礦區(114°23′ ~ 114°59′ E，24°29′ ~ 25°1′ N)優勢植物——烏蕨組織中分離得到的內生真菌，共89株，由九江學院真菌研究室提供。

1.1.2 供試礦樣 鉀長石樣品，由九江學院鄱陽湖生態經濟研究中心礦物研究室提供。礦樣主要化學組成質量分數為K2O 11.09%，Al2O319.25%，SiO266.57%。礦樣粉碎至100目備用。

1.1.3 供試培養基 固體或液體PDA培養基、解鉀脫硅培養基[11-12]。

1.2 方法

1.2.1 解鉀脫硅內生真菌菌株篩選及測定 1) 菌株初篩。將烏蕨內生真菌菌株在PDA 培養基平板上進行活化培養，活化后的菌株挑取菌塊(=0.5 cm)接種至解鉀脫硅固體培養基上，28℃培養 4 ~ 5 d，觀察菌落形態大小、生長速度，進行解鉀脫硅菌株初步篩選。

2) 菌株復篩。將初選得到的菌株(=0.5 cm)接種至 50 ml/150 ml 解鉀脫硅液體培養基中，置于恒溫搖床28℃、150 r/min 發酵培養 15 d，以滅活菌株作對照，每菌株 3 個重復[13]。發酵液采用過氧化氫灰化法[14]處理，取發酵處理液，用Optima 8000 型電感耦合等離子體發射光譜儀(Perkin-Elmer公司)分別測定可溶性鉀和硅的含量[15-16]，然后計算出可溶性鉀(或硅)的凈增加量(mg/L)：=(1－0)，式中：為可溶性鉀(或硅)凈增加量(mg/L)；1為接菌樣品中可溶性鉀(或硅)含量(mg/L)；0為接滅活菌樣品中可溶性鉀(或硅)含量(mg/L)。

3) 菌株生物量測定。按“菌株復篩”中的方法進行液體培養，于0、1、3、6、9、12、15 d對培養液過濾得到的菌體進行干燥，稱重測定菌株生物量(mg/L)，同時以滅活菌株作對照，每菌株3個重復。

4) 菌株對鉀長石礦粉的作用。用體視顯微鏡、掃描電鏡SEM(TESCAN 公司生產，型號為VEGIILSU)、能譜儀(EDS)與X射線衍射儀XRD(日本Rigaku生產，D/Max?2500型)觀察真菌菌株侵蝕前后礦樣的表面微觀形態及礦物結構變化[16]。

1.2.2 高效解鉀、脫硅菌株鑒定 1) 形態學鑒定。依據相關文獻[17-18]，根據菌落形態、產孢方式、孢子形態特征和產孢結構對菌株進行形態學鑒定。

2) 分子生物學鑒定。①基因組DNA提?。簠⒖糂arnett和Hunter[19]及Guo等人[20]的方法，利用反復凍融、SDS-CTAB法提取基因組DNA。②內生真菌DNA 的PCR 擴增[21]：利用真菌通用引物Primer 1 (ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′正向)和Primer 4(ITS4：5′-TCCTCCGCTTATRGATATGC-3′反向)對內生真菌 DNA 的 ITS1、ITS2 和5.8S rRNA 區間進行擴增。擴增體系(50 μl)：Primer 1和Primer 4各0.75 μl，DNA Buffer 2.5 μl，dNTPS各2 μl，Taq E 0.4 μl，DNA模板1 μl (視情況進行不同梯度稀釋，以便達到最好的效果)，ddH2O 17.6 μl。PCR反應程序：94℃預變性 2 min，94℃變性 1 min，55℃引物退火 45 s，72℃延伸 45 s，循環30次，72℃終末延伸10 min。PCR 產物采用純化試劑盒(QiaQuick PCR purification Kit；Qiagen)進行純化，瓊脂糖凝膠電泳進行檢測(上海生物工程有限公司測序完成)。③系統進化樹構建：將測序結果提交NCBI數據庫比對分析，選取相似性較高的典型菌株的序列，利用MEGA5.0軟件構建N-J系統進化樹，其BootsVap(Bootstrap)值設為1 000次重復。

1.2.3 菌株WJ007培養條件的優化 選用解鉀脫硅培養基作為基礎培養基，用葡萄糖、麥芽糖、果糖、乳糖、蔗糖分別代替培養基中的碳源；用酵母膏、硫酸銨、硝酸銨、牛肉膏、蛋白胨分別代替培養基中的氮源；用5∶1、10∶1、20∶1、40∶1、60∶1、80∶1為不同碳氮比；以3、4、5、6、7、8為不同初始pH進行單因素優化試驗[21]。置恒溫搖床28℃、150 r/min 發酵培養15 d，每個處理設3個重復。在以上試驗的基礎上，按正交試驗L9(34) 4因素3水平對菌株搖瓶培養條件進行優化，每組設3個重復。

1.3 數據分析

采用Origin7.5軟件、MEGA5.0軟件進行數據統計分析。

2 結果與討論

2.1 解鉀脫硅內生真菌菌株篩選

根據在解鉀脫硅培養基平板上菌落形態大、生長速度快的特點，從烏蕨89株內生真菌菌株中初步篩選出8株具有解鉀、脫硅能力的菌株(菌株編號分別為WJ005、 WJ006、 WJ007、 WJ010 、WJ012、 WJ064、WJ067、WJ074)。對初篩的8株真菌進行解鉀、脫硅試驗，測定其解鉀、脫硅效應。結果顯示：接種8株內生真菌的發酵培養液中可溶性鉀凈增加量在32.4 ~ 64.23 mg/L，可溶性硅的凈增加量在0.364 ~1.86 mg/L，其中接種WJ007菌株的可溶性鉀、硅凈增加量最高，分別為64.23、1.86 mg/L(圖1A、B)。因此選擇WJ007菌株作為研究對象，進行后續研究。

2.2 菌株生物量的測定

初篩的8株菌株在解鉀脫硅液體培養基中的生物量變化情況如圖2所示。從圖2中可以看出，在培養初期8株菌株在解鉀脫硅液體培養基中菌絲的生長非常接近，隨著培養時間的延長，菌絲生物量迅速上升，培養12 d后，生物量的增加幅度較小。與對照相比，顯示8株菌株均能在含鉀長石培養基中生長，其中，菌株WJ007生長速度最快，生物量最高。

圖1 不同菌株對鉀長石作用能力的篩選(A：解鉀能力；B：脫硅能力)

圖2 不同菌株在含鉀長石培養基中的菌株生物量變化曲線

2.3 WJ007菌株對鉀礦粉的作用

液體培養15 d后，通過體視顯微鏡觀察(圖3)，菌株WJ007作用鉀長石前，菌絲球表面內壁均呈乳白色，而作用鉀長石后菌絲球中包裹許多深褐色的礦粉顆粒，表現出對鉀長石具有較好的親和性。掃描電鏡觀察顯示(圖4)，菌株WJ007作用鉀長石前鉀長石礦樣的棱角清晰，表面圓滑，晶體結構完整；作用鉀長石后WJ007菌株菌絲能有效吸附和纏繞鉀長石礦粉顆粒，形成礦物–真菌聚合體，鉀長石表層被深度侵蝕，且其晶體結構基本被破壞。對WJ007菌株作用后的鉀長石表面進行EDS能譜分析(圖5)，從圖5中可以看出，鉀長石表面K+和Si4+含量明顯高于菌株WJ007作用鉀長石前，進一步說明礦物晶體結構基本被破壞后，K+和Si4+等陽離子被釋放出來。這是因為礦物與菌絲形成的菌絲球微環境為菌絲及其代謝產物分化鉀礦物提供了更為便利的空間，微環境中的大量代謝產物通過質子交換與絡合作用將礦物表面和晶體中的K+和Si4+等陽離子釋放出來[17,22]。

(A：WJ007菌株作用鉀長石前；B：WJ007菌株作用鉀長石后)

2.4 高效解鉀脫硅菌株鑒定

根據WJ007菌株的培養性狀和形態特征，參照孔華忠[23]的描述，可初步確定該菌株屬于青霉屬類曲霉亞屬的小刺青霉Thom(圖6)。

用真菌通用引物ITS1/ITS4對WJ007菌株 rDNA的ITS區進行PCR擴增，所獲PCR產物經測序得到590 bp的堿基序列。通過GenBank(NCBI) Megablast搜索核酸數據庫(blastn)進行比對和同源性分析。WJ007菌株ITS序列的比對結果顯示該序列與小刺青霉的ITS序列同源性為100%，結合形態學特征，支持WJ007菌株為小刺青霉。為了更為直觀地顯示WJ007菌株與青霉屬類曲霉亞屬其他種的親緣關系，采用最大似然法將本研究測定所得的序列與來自GenBank的部分青霉屬類曲霉亞屬序列進行分析并構建系統發育樹(圖7)。系統發育關系表明，WJ007菌株同來自GenBank的小刺青霉(序列登錄號：KM189781、KM189526、KM189448和AF034461)聚為一支，得到了99% 靴帶值的支持，進一步證實了菌株WJ007為小刺青霉。

(A：WJ007菌株作用前的鉀長石；B、C：WJ007菌株孢子吸附在鉀長石上；D、E：WJ007菌株菌絲吸附在鉀長石上；F、G：發酵培養第9 天WJ007菌株對鉀長石的作用；H：發酵培養第12 天WJ007菌株對鉀長石的作用；I、J：發酵培養第15 天后WJ007菌株對鉀長石的作用；K：WJ007菌株作用后的礦樣；L：發酵培養第15 天接種滅活菌株礦樣)

(A：WJ007菌株作用前鉀長石；B：WJ007菌株作用后鉀長石)

(A：菌落；B：掃描電鏡下的產孢結構；C：掃描電鏡下的孢子)

(本試驗所獲菌株序列以粗體標識，靴帶值≥50% 的數值標注于分支上)

2.5 WJ007菌株解鉀脫硅培養條件的優化

2.5.1 單因素試驗 選擇碳源、氮源、碳氮比、初始pH 4個因素，每個因素設定合適的水平數，對菌株WJ007進行培養條件單因素優化，所得結果見圖8。由圖8可知，菌株WJ007最優的解鉀單因素培養條件為：果糖為碳源，硝酸銨為氮源，碳氮比為60∶1，pH為6；最優的脫硅單因素培養條件為：葡萄糖為碳源，蛋白胨為氮源，碳氮比為60∶1，pH為6。

圖8 不同培養條件對WJ007菌株解鉀、脫硅作用的影響

2.5.2 正交試驗 在單因素基礎上，選擇合適的因素和水平(表1)，按L9(34)正交試驗對WJ007菌株解鉀、脫硅培養條件進行優化，每組設置3個重復。由極差分析可知，各因素對WJ007菌株解鉀影響的主次順序為：碳源>初始pH>碳氮比>氮源，從TK1、TK2、TK3值可知，A2B3C2D3組合(碳源為葡萄糖，氮源為蛋白胨，碳氮比為60∶1及初始pH為7)為WJ007菌株解鉀能力的最優培養條件，發酵液中可溶性鉀含量最高，為154.44 mg/L；各因素對WJ007菌株脫硅影響的主次順序為：碳氮比>碳源>初始pH>氮源，從TSi1、TSi2、TSi3值可知，A2B1C2D2組合，即：碳源為葡萄糖，氮源為酵母膏，碳氮比為60∶1及初始pH為6，為WJ007菌株脫硅能力的最優培養條件(表2)，發酵液中可溶性硅含量最高，為9.74 mg/L。正交試驗結果與單因素試驗結果存在差異(表3)，說明培養條件各因素之間存在交互作用，正交試驗結果更具說服力。

表1 正交試驗水平與因素表(L34)

Table 1 Level and factor of orthogonal test(L34)

表2 WJ007菌株解鉀、脫硅正交試驗結果

續表

試驗號ABCD硅含量(mg/L)鉀含量(mg/L) 623128.3785.10 731327.5450.63 832137.6469.45 933217.3060.50 TSi1(TK1)19.67(197.53)22.91(204.43)22.72(208.35)19.98(194.25)T=65.18T=643.16 TSi2(TK2)23.00(265.05)20.64(217.03)22.99(228.13)22.94(203.36) TSi3(TK3)22.48(180.58)21.60(221.70)19.44(206.68)22.23(245.55) tSi1(tK1)6.56(65.84)7.64(68.14)7.57(69.45)6.66(64.75) tSi2(tK2)7.67(88.35)6.88(72.34)7.66(76.04)7.65(67.79) tSi3(tK3)7.49(60.19)7.2(73.90)6.48(68.89)7.41(81.85) R3.33(84.47)2.27(17.27)3.55(21.45)2.96(51.30) 主次順序Si：C>A>D>BK：A>D>C>B 優化組合Si：A2B1C2D2K：A2B3C2D3

注：A、B、C、D分別代表碳源、氮源、碳氮比、pH；T1、T2、T3及T分別代表1、2、3水平的和及總和；t1、t2、t3及R分別代表1、2、3水平的和的均值及極差。

表3 方差分析

注：括號外數據為WJ007菌株解鉀的方差分析；括號內數據為WJ007菌株脫硅的方差分析。

2.5.3 驗證實驗 根據正交試驗優化結果，對WJ007菌株脫硅最佳培養組合，即A2B1C2D2，進行3組驗證實驗，結果顯示，發酵液中硅的含量分別為8.37、8.74、9.11 mg/L，平均含量為8.74 mg/L；對WJ007菌株解鉀最佳培養組合，即A2B3C2D3，進行3組驗證實驗，結果顯示：發酵液中鉀的含量分別為154.56、152.49、151.28 mg/L，平均含量為154.44 mg/L。結果表明，在上述培養條件下，WJ007菌株脫硅、解鉀活性相對穩定，從而達到優化的目的。

3 結論

本研究利用從龍南鉀礦區烏蕨中分離培養獲得的內生真菌進行解鉀脫硅的菌株篩選，共篩選出8株具有解鉀脫硅功能的菌株，其中，WJ007為一株高效解鉀脫硅的菌株。通過對其形態特征以及rDNA-ITS序列的測定和分析，鑒定其為青霉屬的小刺青霉，結合單因素和正交試驗得出WJ007菌株最佳發酵條件組合：碳源為葡萄糖、氮源為蛋白胨、碳氮比為60∶1、初始pH為7的培養條件下，發酵液中可溶性鉀含量最高，為154.44 mg/L；碳源為葡萄糖、氮源為酵母膏、碳氮比為60∶1、初始pH為6的培養條件下，發酵液中可溶性硅含量最高，為8.74 mg/L。通過對WJ007菌株培養條件優化的研究，進一步說明植物內生真菌具有很廣泛的開發應用前景。

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Screening, Identification and Cultivated Condition Optimization of High Efficiency Potassium Solubilization and Desilication Fungus Strain

ZHANG Hongfang, HE Gang, WU Lvying, SUN Desi, CHEN Ye*

(School of Pharmacy and Life Sciences, Jiujiang University, Jiujiang, Jiangxi 332000, China)

In order to excavate the functional endophyte fungi resources, a fungus strain, named WJ007 with high-efficiency potassium solubilization and desilication was screened from, it was identified asbased on morphological characteristics, rDNA ITS sequence and phylogenetic relationships analyses. Its optimal culture conditions obtained by single factor and orthogonal experimens for desiliconization were glucose as carbon source, yeast extract as nitrogen source, carbon and nitrogen ratio of 60∶1, initial pH 6, and culture soluble silicon content in liquid is 8.74 mg/L under these conditions; while its optimal culture conditions for potassium solubilization were glucose as carbon source, protein peptone as nitrogen source, carbon and nitrogen ratio of 60∶1, initial pH 7, and soluble potassium contents in culture solution is 154.44 mg/L under these conditions. It is significant for the development and utilization of plant endophytic fungi to optimize fermentation conditions of potassium solubilization and desiliconization for WJ007.

Endophytic fungi; Potassium-solubilization; Desilication; Isolation; Identification; Fermentation condition

國家自然科學基金項目(31360064；51264014)和江西省自然科學基金項目(20171BAB204007)資助。

(chenyejjtc@126.com)

張紅芳(1971—)，女，江西九江人，碩士，講師，主要從事真菌資源開發利用研究。E-mail：939044612@qq.com

10.13758/j.cnki.tr.2018.05.012

S154. 39

A