超高效液相色譜-串聯質譜測定草莓中醚菌酯殘留量

李國烈，覃明麗，蘇 旭，杜 鑫，蔣金芳，何沛蓉，何家國

(南充農產品質量監測檢驗中心，四川 南充 637000)

醚菌酯化學名稱為(E)-2-甲氧亞氨基-[2-(鄰甲基苯氧基甲基)苯基]乙酸甲酯，屬于甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑，具有高效、廣譜、低毒等特點，其作用機理在于阻斷真菌產生ATP，使真菌停止生長或受到抑制。醚菌酯主要用于防治卵菌綱、藻菌綱、子囊菌綱、半知菌綱的真菌病害，現已被廣泛用于防治草莓白粉病和黃瓜白粉病等病害[2-6]。目前國內外醚菌酯殘留分析方法主要包括液相色譜法、高效液相色譜-串聯質譜法等、氣相色譜法[9-12]和氣相色譜-質譜聯用法[13-14]。醚菌酯在草莓中的殘留檢測方面，李輝等[15]報道了采用氣相色譜法測定醚菌酯在草莓中的殘留，他們使用丙酮提取，二氯甲烷萃取，弗羅里硅土層析柱凈化，氣相色譜儀石英毛細管柱分析，外標法定量。最終得出在0.006和1.000mg/kg添加水平下(5個平行)，平均回收率分別為88.19%和92.02%，回收率相對標準偏差分別為7.76%和7.47%。趙爾成等[16]報道了采用氣相色譜-質譜儀測定草莓中醚菌酯的殘留，他們采用乙腈提取，PSA和無水硫酸鎂凈化，氣相色譜-質譜儀DB-5 MS色譜柱分析。最終指出該方法的檢出限為0.05mg/kg，并且在0.05和0.5mg/kg添加水平下(5個平行)，醚菌酯的回收率在85.3%～104.5%，平均為97%和92%，相對標準偏差分別為6.8%和7.3%。到目前為止，尚未見報道采用超高效液相色譜-串聯質譜測定醚菌酯在草莓中的殘留。本試驗建立了草莓中醚菌酯殘留檢測的超高效液相色譜-串聯質譜方法(UPLC-MS/MS)，以期為進行風險評估和監測食品安全提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 試驗藥品和試劑 醚菌酯標準品購于農業部環境保護科研監測所(編號：SB-212-2008)，甲醇、乙腈，甲苯，甲酸均為色譜級，購自Fisher公司。

1.2 儀器和設備 超高效液相色譜-質譜儀(Waters，UPLC-TQS)，色譜柱(Waters，Xbridge C18，3.5μm 3.0×50mm)，超純水儀(Millipore，Milli-Q)，旋渦混合器(IKA，Vortex Genius 3)，勻漿機(IKA，T25)，旋轉蒸發儀(上海亞榮，RE-2000A)，固相萃取小柱(Agilent，CARB/NH2500mg/6mL)，固相萃取裝置(Agilent)以及微孔濾膜(津騰，PTFE 0.22μm)等。

1.3 樣品前處理 準確稱取勻漿后的草莓樣品25.00g于250mL三角瓶中，加入50.00mL乙腈，用勻漿機高速勻漿2min后用濾紙過濾，濾液收集到裝有10g氯化鈉的100mL具塞量筒中，蓋上塞子，劇烈震蕩1min，在室溫下靜置30min，移取出上清液10.00mL待凈化。

1.4 樣品凈化 將移取的10.00mL提取液加入已經過5 mL乙腈+甲苯(3∶1，V/V)預淋洗ProElut CARB/NH2柱(500mg/6mL)，收集淋洗液，再用25mL乙腈+甲苯(3∶1，V/V)分5次洗脫，合并淋洗液，于40℃水浴鍋蒸發近干，用5.00mL 70%甲醇定容，過0.22μm濾膜，待檢測。

1.5 超高效液相色譜-質譜條件 流動相采用甲醇，乙腈和含有0.1%甲酸水溶液進行梯度洗脫，洗脫程序(表1)，流動相使用前用超聲波脫氣。柱溫：40℃，進樣量：3.0μL。質譜采用電噴霧離子源正離子模式(ESI+)，多反應監測(MRM)方式進行采集，相關參數(表2)。

表1 流動相及梯度洗脫條件

表2 測定醚菌酯在草莓中殘留的質譜參數

1.6 標準曲線和檢測限 分別取一定量的醚菌酯標品溶液用草莓空白基質配制成濃度為0.50、1.00、2.00、5.00、10.00、20.00和50.00μg/L的標準液，采用1.5儀器條件進行分析，以醚菌酯定量離子的峰面積為縱坐標，質量濃度為橫坐標作標準曲線，并進行回歸分析求出回歸方程和相關系數。標準曲線采用Masslynx V4.1軟件繪制。檢測限采用在最低濃度附近添加一系列已知濃度的雙份樣品進行測定，采用Masslynx V4.1軟件計算醚菌酯的信噪比(S/N)，以S/N≥3時的樣品濃度為方法檢測限[17]。

1.7 加標回收和精密度 取草莓空白樣品，根據高、中、低3個濃度分別加入相應的醚菌酯標準溶液，每個濃度水平做6個平行質控樣品。所有樣品按1.3和1.4進行樣品前處理，采用1.5儀器條件測定藥物濃度，計算方法的加標回收。精密度試驗采用加入法。取草莓空白樣品，根據高、中、低3個濃度分別加入相應的醚菌酯標準溶液，每個濃度水平做6個平行。所有樣品按1.3和1.4進行樣品前處理，采用1.5儀器條件測定藥物濃度，連續測定3d，根據隨行測定的標準曲線計算樣品的實測濃度，即可求得方法的日內和日間精密度。

1.8 基質效應、提取回收率和方法過程效率 采用Matuszew ski等[18]提出的方法，比較不同條件下的峰面積平均值。在純的醚菌酯標品溶液(A)，草莓樣品基質提取后添加醚菌酯標品(B)和草莓樣品基質提取前添加醚菌酯標品(C)3個條件下，分別采用高、中、低3個濃度來評價醚菌酯在草莓樣品中的基質效應、提取回收率和過程效率，每個條件下重復測定6個樣品。基質效應=B/A，提取回收率=C/B，方法過程效率=C/A。

2 結果與分析

2.1 方法選擇性 該試驗條件下，醚菌酯采用反相液相色譜分離，流動相中加入0.1%體積分數的甲酸來提高ESI+的離子化效率。結果表明，醚菌酯保留時間適中(5.25min)，峰形及分離度良好，且可獲得較強的分子離子峰強度，草莓基質對草莓樣品中醚菌酯的測定無干擾。醚菌酯標準溶液圖譜、草莓空白樣品圖譜、醚菌酯草莓基質匹配標液和草莓樣品加標圖譜(圖1、圖2、圖3和圖4)。

圖1 醚菌酯標準溶液圖譜(0.50μg/L)圖2 草莓空白樣品圖譜圖3 醚菌酯草莓基質標液圖譜(0.50μg/L)圖4 草莓加標樣品圖譜(0.50μg/L)

2.2 標準曲線和檢測限 醚菌酯標準曲線在質量濃度0.50～50.00μg/L時線性關系良好，標準曲線回歸方程為y=4.284 17×106x+228.13(R2=0.998)。以3倍基線噪音的藥物濃度為最低檢測限，醚菌酯在草莓中的方法檢出限(method detection limit，MDL)為0.10μg/kg。以4倍MDL為測定下限，即4倍方法檢出限濃度作為測定下限，則醚菌酯在草莓中的測定下限為0.50μg/kg[17]。

2.3 加標回收和精密度 醚菌酯在0.50、5.00和50.00μg/kg 3個濃度的草莓添加樣品回收率

分別為95.4%、94.3%和92.2%，日內精密度相對標準偏差分別為3.75%、3.36%和2.57%，日間精密度相對標準偏差分別為5.34%、4.24%和5.04%，(表3和表4)。表明該試驗方法在測定草莓中醚菌酯的殘留時具有較好的準確度。

表3 草莓中醚菌酯加標回收(n=6)

表4 草莓中醚菌酯日內精密度和日間精密度(n=6)

2.4 基質效應、提取回收率和方法過程效率 該試驗條件下，采用提取后加入法從3個濃度水平來評價醚菌酯在草莓樣品中的基質效應、提取回收率和過程效率，其結果(表5)。在0.50、5.00和50.00μg/L 3個濃度水平下，醚菌酯在草莓樣品中的基質效應分別為(96.08±5.01)%、(93.21±1.67)%和(93.31±0.74)%，表現為基質抑制效應，并且基質效應影響較小；提取回收率分別為(95.41±3.51)%、(94.37±4.14)%和(92.19±2.11)%，相應的相對標準偏差分別為3.69%，4.39%和2.29%，均滿足農藥殘留試驗準則的要求[19]；方法過程效率分別為(91.64±5.19)%、(87.92±2.96)%和(86.02±1.86)%，表明該試驗方法方法過程效率較好。

表5 3個不同濃度下的信號峰面積及基質效應、回收率和過程效率的計算結果(n=6)

3 討論

該試驗樣品采用乙腈提取，石墨化碳黑氨基復合柱凈化，超高效液相色譜-質譜法(UPLC-MS/MS)檢測醚菌酯在草莓中的殘留，該方法前處理過程操作簡便，方法的選擇性好。檢測限和定量限均低于GB 2763-2016中規定醚菌酯在草莓中的最大限量值(2 mg/kg)[20]，回收率、精密度和提取回收率均滿足農藥殘留試驗準則的要求。另外，通過基質效應的結果可以得出該試驗方法基質效應對結果沒有顯著的影響，因此，該試驗方法也可以不采用空白基質配制標準溶液，以簡化試驗過程。