MdWRKY40介導提高蘋果與擬南芥對輪紋病菌的免疫抗性

周茜茜，邱化榮，何曉文，王憲璞，劉秀霞，李保華，吳樹敬，陳學森

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介導提高蘋果與擬南芥對輪紋病菌的免疫抗性

周茜茜1，邱化榮1，何曉文1，王憲璞1，劉秀霞1，李保華2，吳樹敬1，陳學森1

（1山東農業大學園藝科學與工程學院/作物生物學國家重點實驗室，山東泰安 271018；2青島農業大學植物醫學學院，山東青島 266109）

【目的】從‘富士’蘋果中克隆，研究其在水楊酸（SA）誘導條件下的表達模式及在蘋果輪紋病抗病信號通路中的作用，為進一步揭示蘋果的抗病機制提供理論依據。【方法】以‘富士’蘋果為試材，克隆的全長CDS序列，對其進行生物信息學分析，采用熒光定量PCR（qRT-PCR）分析其在蘋果各組織中的表達水平，及對非生物脅迫SA的響應；研究外源SA處理對蘋果葉片接種輪紋病菌（）的影響，并利用qRT-PCR檢測病程相關蛋白基因的表達；將在擬南芥中進行異源表達，對穩定表達的擬南芥幼苗葉片進行接菌處理，觀察葉片發病程度及發病葉片數量，并采用qRT-PCR分析病程相關基因的表達；測量擬南芥幼苗的根系長度，并利用qRT-PCR檢測生長素相關基因的表達。【結果】包含長為858 bp完整的開放閱讀框，編碼286個氨基酸，預測其分子量為32.088 kD，等電點為8.15。系統進化樹分析表明，MdWRKY40與白梨PbWRKY40序列相似性最高，親緣關系最近，與擬南芥AtWRKY40在不同的分支上，親緣關系較遠，利用DANMAN軟件進行MdWRKY40與AtWRKY40的多序列比對分析發現，MdWRKY40蛋白與AtWRKY40蛋白雖然都含有一個WRKYGQK保守結構域，但相似度僅為29.78%。qRT-PCR分析表明，在根中的表達水平最高，在葉中的表達水平最低，并且在根、莖、葉中，SA均誘導了的表達，且均呈現先升高后降低的趨勢，在6 h時表達量最高；外源SA處理提高了蘋果葉片對輪紋病菌的抗性，未處理的葉片發病率達92.59%，SA處理后發病率降至79.26%，并顯著提高了病程相關蛋白基因、的表達量。與野生型相比，在擬南芥中異源過量表達顯著提高了擬南芥葉片對輪紋病菌的抗性，野生型擬南芥發病率達77.5%，而兩個轉基因擬南芥株系發病率僅為21.5%和17.4%，并顯著提高了病程相關基因、、的表達。過表達的擬南芥植株根系生長受到抑制，培養7 d后轉基因擬南芥主根長度分別是野生型擬南芥的39.9%和43.1%，培養10 d后主根長度分別是野生型擬南芥的58.5%和55.4%。基因表達結果顯示，生長素合成相關基因和生長素運輸相關基因、的表達水平在過表達株系中顯著低于野生型。【結論】表達受SA和蘋果輪紋病菌侵染誘導；是蘋果中重要的輪紋病抗病基因，該基因過表達顯著提高對輪紋病菌的抗性；具有調控植物根系生長發育的功能，可能通過下調生長素運輸相關基因的表達影響植物根系生長發育。

蘋果；；水楊酸；蘋果輪紋病菌；免疫抗性；根系生長

0 引言

【研究意義】蘋果味道鮮美，營養豐富，是世界范圍內深受消費者喜愛的水果之一，但蘋果的產量及其品質極易受生物和非生物脅迫的危害[1]，蘋果輪紋病菌（葡萄座腔菌，）是兼性菌，既可以營腐生又可以營活體[2]，輪紋病是蘋果生產中最重要的病害之一，可危害蘋果的枝干和果實，在田間和貯藏期均可使蘋果發病[3]。目前生產上主栽品種‘富士’，以及‘元帥’‘嘎啦’等均為輪紋病易感品種，給蘋果生產造成巨大的經濟損失。近年來，果實套袋技術和化學藥劑防治是蘋果輪紋病主要的防治措施，但果實套袋無法解決枝干輪紋病危害，化學藥劑的使用又會對環境造成影響。進行具有抑菌功能的有效藥劑與生防菌篩選，是目前研究者試圖解決蘋果果實及枝干輪紋病的重要嘗試[4-5]。但迄今為止，一直沒有低毒環保并能夠有效防治蘋果枝干及果實輪紋病的有效藥劑。因此，抗病品種培育是解決輪紋病對蘋果產業造成巨大危害的另一重要嘗試。而對于蘋果抗病信號轉導途徑進行研究，揭示和鑒定蘋果抗病基因，是利用抗病基因資源進行蘋果抗病品種培育和種質資源選育的前提條件。【前人研究進展】WRKY轉錄因子作為植物中最大的轉錄因子家族之一，其中一個主要功能是與植物的抗病和生長發育有關，在植物的抗病反應調控網絡中起著關鍵作用[6-7]。WRKY轉錄因子可以調控抗病信號通路中的關鍵基因，如在擬南芥中，通過與啟動子中的W-box結合來調控下游基因的表達，進而調控植物的抗病性[8]。WRKY轉錄因子還可以通過與蛋白的直接結合來調控植物的抗病性，如大麥中和編碼的蛋白則通過與MLA（mildew- resistance locus A）互作來調控大麥對白粉病的抗性[9]。近年來，越來越多的研究發現，WRKY轉錄因子參與植物的各種生理過程，包括生長和發育[10-11]、非生物脅迫響應[12-14]和生物脅迫響應[15-19]。WRKY轉錄因子通過結合靶基因啟動子中的順式作用元件W-box（TTGACC/T）來調控基因表達[20]。除了W-box外，WRKY轉錄因子還可以結合其他元件，如糖響應（SURE）順式作用元件（TAAAGATTACTAATAGG AA）和病原體響應元件PRE4（TGCGCTT），表明其功能機制的多樣性[21]。進一步的研究顯示，WRKY轉錄因子的主要生物學功能是調控植物的抗病反應及參與信號轉導途徑的建立。在本氏煙中，沉默降低了本氏煙對半活體營養型寄生疫霉Pp025菌株和死體營養型灰霉病菌的抗性[22]，Xu等研究表明和雙突變體和三重突變體提高了擬南芥對丁香假單胞菌DC3000的抗性，但降低了擬南芥對灰霉病菌的抗性[23]，雙突變體也提高了擬南芥對白粉病菌的抗性[24]。除了參與生物脅迫外，WRKY轉錄因子還廣泛參與了非生物脅迫，在擬南芥中，受E-2-己烯醛誘導[14]，羅昌國等[25]研究發現，水楊酸（SA）可以強烈誘導的表達。WRKY轉錄因子在植物的根系生長發育中也發揮著重要作用，如在水稻中，過表達顯著降低了植株的株高并增加了根的長度[26]。【本研究切入點】在蘋果輪紋病抗病信號通路中的具體功能和作用機制尚未見報道。【擬解決的關鍵問題】通過鑒定的生物學功能，闡明其在抵御蘋果輪紋病菌侵染中的作用，為進一步揭示蘋果的抗病機制以及培育抗病新品種提供理論依據。

1 材料與方法

試驗于2016—2017年在山東農業大學作物生物學國家重點實驗室進行。

1.1 材料

分別以山東農業大學植物生長室生根28 d的‘嘎啦’蘋果組培苗的根、莖、葉，山東農業大學南校區果樹實驗站培育的‘富士’蘋果果實和在22℃，相對濕度60%，10 h/14 h光暗周期條件下培養的哥倫比亞野生型擬南芥幼苗為試材。蘋果輪紋病菌所使用株系為No.040301[27]。

1.2 RNA提取及cDNA制備

總RNA的提取按照康為世紀生物科技有限公司的OminiPlant RNA Kit（DNaseI）提取試劑盒說明書進行，從‘富士’蘋果果皮中提取總RNA，應用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit（Thermo Scientific）反轉錄試劑盒并參照其說明書反轉錄為cDNA，-20℃保存備用。

1.3 熒光定量PCR（qRT-PCR）

熒光定量儀器為伯樂CFX96分析儀，總反應體系為5 μL FastStart Universal SYBR Green Master（Roche），上下游引物各0.3 μL（10 μmol·L-1），模板1 μL，ddH2O補足至10 μL。反應程序：95℃預變性10 min，95℃變性15 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，40個循環。內參基因為蘋果肌動蛋白基因（序列號為GQ339778），基因相對表達量通過2-△△CT法計算，每個PCR反應3次重復。使用SPSS17.0軟件進行基因表達差異的顯著性分析（＜0.05）。所使用qRT-PCR引物如表1所示。

1.4 MdWRKY40超表達載體構建

根據在GDR網站（https://www.rosaceae.org/）中檢索到的序列設計引物：MDP0000263349（）-HI-F：5′- CGGGATCCATGGATGC TCGTACGCCTAAC-3′；MDP0000263349（）-I-R：5′-GAAGGCCTATTTGGCCTGTCTGCAGGT C-3′。以‘富士’蘋果果皮cDNA為模板，進行PCR擴增。反應程序：98℃預變性3 min；98℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，35個循環；72℃延伸10 min。應用HI、I酶切PCR產物和pCB302二元表達載體，PCR產物與表達載體骨架用1.5%瓊脂糖凝膠電泳分別回收，然后將回收的PCR產物與載體利用T4 DNA連接酶在16℃條件下連接8 h以上，轉化大腸桿菌，進行克隆的篩選鑒定并測序。所用限制性內切酶和T4 DNA連接酶均購自NEW ENGLAND Biolabs公司。

1.5 MdWRKY40的生物信息學分析

通過Expasy網站（http://web. expasy.org/protparam/）對MdWRKY40蛋白進行理化性質分析，利用DANMAN軟件進行多序列比對分析，采用MEGA5.0軟件neighbor-joining（NJ）法構建系統進化樹，建樹參數No. Of Bootstrap Replications為1 000，其他參數默認。

表1 熒光定量PCR引物序列

1.6 農桿菌介導的擬南芥的遺傳轉化

將構建的過表達載體轉化農桿菌GV3101，PCR篩選獲得陽性農桿菌，然后采用農桿菌介導的浸花法進行擬南芥的遺傳轉化[28]。

1.7 外源SA處理對蘋果葉片接種輪紋病菌的影響

選取生長30 d，生長狀態一致的離體‘嘎啦’葉片，將其浸泡在0.5 mmol·L-1的SA中6 h，然后使用在28℃暗培養7 d后的蘋果輪紋病菌進行接種。將接菌后的葉片放在黑暗、28℃恒溫培養箱內發病3 d，之后觀察記錄葉片發病情況，并分別提取發病葉片的RNA，進行病程相關蛋白基因的定量表達，重復3次。葉片的輪紋病菌接種方法參照文獻[29]。

1.8 擬南芥根系生長測定

將轉基因擬南芥經過噴施除草劑（5 mg·L-1）篩選以后，PCR檢測得到陽性轉基因植株，收集種子，將陽性轉基因植株播種到MS+除草劑（8 mg·L-1）的抗性培養基上，經過連續3代篩選獲得T3代純合體，收取種子。

將野生型擬南芥和轉基因株系的種子播種到MS培養基上，豎直培養7 d，10 d后測量幼苗的根長，野生型擬南芥和轉基因株系各取30株計算其平均值，3次重復。整株取樣，用液氮凍存，進行生長素合成和運輸相關基因的定量表達。

1.9 擬南芥葉片的輪紋病菌接種

選取生長30 d，生長狀態相同的轉基因和非轉基因擬南芥葉片，使用在28℃暗培養5 d后的蘋果輪紋病菌進行接種。將接菌后的葉片放在黑暗、24℃恒溫培養箱內發病3 d，之后觀察記錄葉片發病情況，并分別提取接種2 d后轉基因和非轉基因擬南芥發病葉片的RNA，進行病程相關蛋白基因的定量表達，重復3次。

2 結果

2.1 MdWRKY40的克隆與生物信息學分析

以‘富士’果皮的cDNA為模板，經PCR擴增獲得了一條大小約為900 bp的條帶（圖1-A），測序分析表明該基因包含一個長為858 bp完整的開放閱讀框，編碼286個氨基酸。將回收的條帶連接到pCB302二元表達載體，挑取陽性克隆應用HI、I進行酶切驗證，切出一條長為858 bp的條帶，與預期完全一致（圖1-B），因此，開放閱讀框序列已成功克隆到表達載體pCB302-35S-2HA中。

Expasy預測其分子量為32.088 kD，等電點為8.15，用DANMAN軟件進行多序列比對分析發現，MdWRKY40蛋白與擬南芥AtWRKY40蛋白相似度為29.78%，都含有一個WRKYGQK保守結構域（圖1-C）。

2.2 MdWRKY40系統進化樹分析

從蘋果基因組數據庫中下載的基因序列，從擬南芥基因組數據庫（http://www.arabidopsis. org/index.jsp）中下載的基因序列，在NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）上用MdWRKY40蛋白序列進行Blast分析，得到白梨、桃、棗等20個不同物種的WRKY40同源蛋白序列，利用MEGA5.0 軟件將以上22個蛋白序列構建系統進化樹，發現蘋果MdWRKY40與白梨PbWRKY40在同一個分支上，親緣關系最近（圖2）。

A：MdWRKY40編碼區全長的PCR擴增PCR amplification of the full length of MdWRKY40；B：pCB302-35S-MdWRKY40-2HA表達載體酶切驗證Digestion result of pCB302-35S-MdWRKY40-2HA expression vector；C：MdWRKY40與AtWRKY40蛋白序列比對MdWRKY40 and AtWRKY40 protein sequence alignment

圖2 MdWRKY40與其他物種WRKY40系統進化樹分析

2.3 MdWRKY40的組織表達分析及對生物和非生物脅迫的響應

qRT-PCR分析表明，在根中的表達水平最高，在葉中的表達水平最低（圖3-A）。‘嘎啦’蘋果葉片接種蘋果輪紋病菌3 d后，提取發病葉片的RNA做qRT-PCR后發現，與對照相比，的表達量顯著升高，表明蘋果輪紋病菌可誘導的表達（圖3-B）。用0.5 mmol·L-1的SA噴施生根四周的‘嘎啦’組培苗，植株無明顯變化，在0、3、6、12、24、36、48 h時取樣，熒光定量結果顯示，在根、莖、葉中，SA強烈誘導了的表達，且均呈現先升高后降低的趨勢，在6 h時表達量最高（圖3-C）。

2.4 SA處理對蘋果葉片輪紋病抗性的影響

用0.5 mmol·L-1的SA處理生長30 d的‘嘎啦’葉片6 h后接種蘋果輪紋病菌，3 d后發現，與對照相比，用SA處理的‘嘎啦’葉片發病程度輕，未處理的葉片有48.15%基本全部發黃腐爛，處理后的葉片只有22.96%基本全部發黃腐爛，大部分葉片只有輕微黃化腐爛現象，且處理后發病葉片少，未處理的葉片發病率達到了92.59%，用SA處理后發病率降至79.26%（圖4-A、4-B）。熒光定量結果顯示，用SA處理后，與病程相關蛋白基因、的表達量顯著高于對照（圖4-C），表明SA處理可以提高蘋果葉片對輪紋病菌的抗性，并且可能參與了SA抗病信號途徑。

柱上不同小寫字母表示差異顯著（＜0.05）；**表示差異極顯著（＜0.01）。下同Different lowercase letters on the column indicate significant differences (＜0.05); ** indicates extremely significant difference (＜0.01). the same as below

A：的組織表達分析Expression analysis of；B：輪紋病菌處理‘嘎啦’葉片對表達的影響Effect ofinfection on the expression of；C：SA處理‘嘎啦’組培苗對表達的影響Effect of SA on the expression of

圖3的組織表達分析及對水楊酸、輪紋病菌侵染誘導后的表達

Fig. 3 Expression analysis ofdifferent tissues of apple and expression after induced by salicylic acid andinfection

2.5 異源表達MdWRKY40對擬南芥葉片輪紋病抗性的影響

2.5.1 轉基因擬南芥的鑒定 將構建的過表達載體轉化農桿菌GV3101，然后用浸花法侵染擬南芥，利用35S啟動子引物35SProsequencing：5′-CCTCTCACCTTTTCGCTGTAC-3′和克隆引物MDP0000263349（）-I-R：5′-GAAGGCCT ATTTGGCCTGTCTGCAGGTC-3′進行PCR鑒定獲得陽性轉基因植株（圖5-A），然后利用半定量和定量PCR進一步驗證陽性轉基因植株，半定量結果表明在轉基因株系7#、12#中的表達量顯著高于野生型擬南芥（圖5-B），qRT-PCR結果顯示，轉基因擬南芥中的表達量分別為野生型擬南芥的585倍和545倍，與半定量結果一致，證明已轉入擬南芥中，并成功表達（圖5-C）。

A：SA處理蘋果葉片接種輪紋病菌表型，SA代表僅用SA處理后的葉片，CK代表未做任何處理的葉片，SA-B. dothidea代表用SA處理后接種輪紋病菌的葉片，B. dothidea代表僅接種輪紋病菌的葉片SA treatment of apple leaves inoculated with B. dothidea phenotype, SA represents the leaves treated only with SA, CK represents the leaves without any treatment, SA-B. dothidea represents the leaves of inoculated with B. dothidea after treatment with SA, and B. dothidea represents the leaves of inoculated only with B. dothidea；B：SA處理蘋果葉片接種輪紋病菌發病葉片統計，縱軸表示發病葉片占總葉片的比例，橫軸表示病斑面積占葉片總面積的百分比SA treatment of apple leaves inoculated with B. dothidea leaf incidence statistics, the vertical axis indicates the proportion of diseased leaves to total leaves, and the horizontal axis indicates the percentage of lesion area to the total area of the leaves；C：qRT-PCR分析MdWRKY40和病程相關基因的表達水平qRT-PCR analysis of MdWRKY40 and disease-associated gene expression levels

A：PCR鑒定轉基因擬南芥，7#、12#是兩個轉基因株系，Col代表野生型擬南芥，CK代表未加模板，質粒代表pCB302-35S-MdWRKY40-2HA Identification of transgenic A. thaliana by PCR, 7# and 12# are two transgenic lines, Col represents wild type A. thaliana,CK represents no template, and plasmid represents pCB302-35S-MdWRKY40-2HA；B：RT-PCR分析野生型擬南芥和異源表達株系中MdWRKY40的表達量RT-PCR analysis of MdWRKY40 expression in wild type A. thaliana and heterologous expression lines；C：qRT-PCR分析野生型擬南芥和異源表達株系中MdWRKY40的表達量qRT-PCR analysis of MdWRKY40 expression in wild type A. thaliana and heterologous expression lines

2.5.2 超表達擬南芥葉片接種蘋果輪紋病菌表型 選取生長狀態相同的轉基因和非轉基因擬南芥葉片，進行蘋果輪紋病菌接種，發病3 d后發現轉基因擬南芥的發病程度明顯比野生型擬南芥輕，野生型擬南芥發病葉片全部發黃腐爛，轉基因擬南芥葉片只有輕微黃化現象，并未出現腐爛狀況（圖6-A），且轉基因擬南芥比野生型擬南芥發病葉片少，野生型擬南芥發病率達到了77.5%，而轉基因擬南芥發病率 只有21.5%和17.4%（圖6-B）。

2.5.3 超表達對接菌后擬南芥葉片中PR基因表達水平的影響 為了進一步研究在蘋果輪紋病抗病信號通路中的作用，通過qRT-PCR方法檢測發病葉片中病程相關蛋白基因的表達水平，結果顯示轉基因擬南芥中病程相關蛋白基因、、的表達量顯著高于野生型擬南芥（圖7）。

A：野生型擬南芥及轉基因株系葉片接種輪紋病菌表型Phenotype of wild type and transgenic A. thaliana leaves after inoculation with B. dothidea；B：野生型和轉基因擬南芥葉片接種輪紋病菌發病統計Incidence statistics of wild type and transgenic A. thaliana leaves after inoculation with B. dothidea

圖7 轉基因擬南芥葉片中病程相關基因的表達水平

Fig. 7 Expression of disease-associated genes in transgenic

2.6 超表達MdWRKY40對擬南芥根系的影響

2.6.1 對擬南芥主根的影響 將野生型擬南芥和兩個轉基因株系的種子播種到MS培養基上，培養7、10 d后測量幼苗的根長，發現與野生型擬南芥相比，轉基因擬南芥的根系生長明顯受到抑制（圖8-A），培養7 d后主根長度分別是野生型擬南芥的39.9%和43.1%，培養10 d后主根長度分別是野生型擬南芥的58.5%和55.4%（圖8-B）。

2.6.2 對擬南芥生長素相關基因表達的影響 為了進一步研究調控擬南芥根系生長發育的機理，通過qRT-PCR檢測轉基因株系中生長素相關基因的表達情況，結果顯示生長素合成相關基因和生長素運輸相關基因的表達量顯著低于野生型擬南芥（圖9）。

A：轉基因擬南芥和野生型擬南芥根系生長狀況，7 d中標尺為0.5 cm，10 d中標尺為1.2 cm The root growth status of transgenic and wild type A. thaliana, Scale bar is 0.5 cm in 7 d and 1.2 cm in 10 d；B：轉基因擬南芥和野生型擬南芥根長統計Statistical analysis of root length of transgenic and wild type A. thaliana

3 討論

3.1 超表達MdWRKY40提高擬南芥葉片對蘋果輪紋病的抗性

為了適應外界環境，植物進化出多種防御機制 來抵抗病原菌侵染。研究表明，WRKY轉錄因子廣泛參與植物的生物和非生物脅迫響應，在抗病信號通路中發揮至關重要的作用。不同植物中WRKY轉錄因子數量不同，而WRKY轉錄因子在各種抗病信號通路中所起的作用也不盡相同，在辣椒中，與促進了植物對青枯病菌的抗性[30]，但抑制了植物對青枯病菌的抗性[31]。在擬南芥中，作為腐生性真菌黑斑病菌和灰霉病菌的正向調節因子起作用[32]，而在富士蘋果中，可能作為白粉病菌的負調節因子起作用[25]。由此可見，WRKY轉錄因子在響應生物脅迫過程中的作用復雜，而且值得注意的是，植物激素如脫落酸（ABA）、水楊酸（SA）、茉莉酸（JA）和乙烯（ETH），在調節植物生長發育和防御各種生物和非生物脅迫中發揮著關鍵作用[33-35]，如外源SA處理可增強蘋果果實對灰霉病的抗性[33]。已有研究證實WRKY轉錄因子的調控作用與多種植物激素介導的信號途徑密切相關，如在擬南芥中，和SA信號傳導途徑，作為負調節因子調控JA信號傳導途徑[36]。其在擬南芥、煙草和水稻等模式植物中已有較深入研究，但在蘋果等多年生木本植物中的研究較少。近年來，主栽蘋果品種，尤其是‘富士’，輪紋病的發生呈逐年上升的趨勢，本研究中SA和蘋果輪紋病菌都強烈誘導了的表達，并且SA可快速誘導的表達，呈現先升高后降低的趨勢，此結果與邱化榮等[37]的研究結果一致，這可能與WRKY轉錄因子的反饋調節機制有關，如在擬南芥中，可抑制其自身啟動子的活性[38]。本研究還發現在擬南芥中異源表達后顯著提高了擬南芥葉片對蘋果輪紋病菌的抗性以及病程相關蛋白基因PR的表達量，外源SA處理蘋果葉片后也提高了其對輪紋病菌的抗性及病程相關蛋白基因PR的表達量，這表明可能在SA介導的抗病信號通路中具有至關重要的作用，蘋果基因編碼區保守性較高，不同品種之間差別較小，而根據能夠被抗性激素SA強烈誘導表達，并且該基因在擬南芥葉片中過表達能夠顯著提高對輪紋病菌侵染抗性的這一研究結果，該基因有望成為在蘋果育種中進行抗病品系篩選的重要標志性基因，及進行蘋果抗病品種培育的重要候選基因。而闡明在‘嘎啦’的抗病信號通路中的具體作用，有利于進一步揭示蘋果的抗病機制。在SA介導的抗病信號通路中的具體作用機制有待進一步研究。

圖9 轉基因擬南芥和野生型擬南芥生長素相關基因的表達水平

Fig. 9 Expression of auxin-related genes in transgenic and wild type

3.2 超表達MdWRKY40抑制擬南芥根系生長

WRKY轉錄因子不僅在抗病過程中具有重要作用，許多研究已經明確WRKY轉錄因子在種子萌發[39]、側根形成[40]、開花時間[41]、果實成熟[42]、葉片衰老[38]和代謝過程等各種生理過程中也具有重要作用。例如，沉默大豆中的和嚴重的發育不良和植株矮小[43]，在水稻中，過表達可減少側根的形成和延伸，并可能改變了生長素的應答和轉運[40]，在擬南芥中，沉默后，側根的長度和數量以及根毛的數量都顯著增加[44]。本研究中，在擬南芥中異源表達后明顯抑制了擬南芥主根的伸長和生長素合成相關基因以及生長素運輸相關基因的表達，說明很可能是通過調控生長素相關基因的表達來抑制擬南芥主根的伸長，與Zhang等[40]在水稻中的研究結果相似。

本研究中，MdWRKY40與白梨PbWRKY40親緣關系最近，與擬南芥AtWRKY40蛋白相似度為29.78%。在擬南芥中，作為蘋果輪紋病抗性的正向調節因子起作用，并抑制擬南芥的根系發育，但蘋果與擬南芥還有較大差別，在蘋果中的功能是否與擬南芥一致？其在蘋果中的具體作用機制還有待進一步研究。

4 結論

表達受水楊酸（SA）和蘋果輪紋病菌侵染所誘導；是蘋果中重要的輪紋病抗病基因，該基因過表達顯著提高對輪紋病菌的抗性；具有調控植物根系生長發育的功能，可能通過下調生長素運輸相關基因的表達影響植物根系生長發育。

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Mediated improvement of the immune Resistance of Apple andto

ZHOU QianQian1, QIU HuaRong1, HE XiaoWen1, Wang XianPu1, LIU XiuXia1, LI BaoHua2, WU ShuJing1, CHEN XueSen1

(1College of Horticultural Science and Engineering, Shandong Agricultural University/State Key Laboratory of Crop Biology, Taian 271018, Shandong;2College of Plant Health and Medicine, Qingdao Agricultural University, Qingdao 266109, Shandong)

【Objective】The objective of this study is to clonefrom ‘Fuji’ apple, research its expression pattern under salicylic acid (SA)-induced conditions and its role in the disease resistance pathway of, and to provide a theoretical basis for further revealing the disease resistance mechanism of apple.【Method】The full-length CDS sequence ofwas cloned from ‘Fuji’ apple, and its bioinformatics analysis was carried out. Fluorescence quantitative PCR (qRT-PCR) was used to analyze the expression level in different apple tissues and the response to abiotic stress SA, to study the effect of exogenous SA treatment on apple leaves inoculated with pathogenic fungi, and to detect the expression of pathogenesis-related protein gene by qRT-PCR.was expressed heterologous in, and the stably expressedseedlings were treated withto observe the degree of disease and the number of infected leaves. The expression of disease-associated genes was analyzed by qRT-PCR. The root length ofseedlings was measured and the expression of auxin-related genes was detected by qRT-PCR.【Result】contains a complete open reading frame of 858 bp in length and encodes 286 amino acids. The predicted molecular weight is 32.088 kD and the isoelectric point is 8.15. Phylogenetic tree analysis showed that MdWRKY40 has the highest similarity with the PbWRKY40 sequence, and its genetic relationship is closest. MdWRKY40 and AtWRKY40 locate in different branches, and its genetic relationship is far from that of AtWRKY40. The multiple sequence alignment analysis of MdWRKY40 and AtWRKY40 by using DANMAN software revealed that both MdWRKY40 protein and AtWRKY protein contain a WRKYGQK conserved domain, but similarity is only 29.78%. qRT-PCR analysis showed that the expression level ofwasthe highest in root and lowest in leaf. SA inducedexpression in root, stem and leaf, and the expression all increased first and then decreased, reached the highest level at 6 h. Exogenous SA enhanced the resistance of apple leaves to, the incidence of untreated leaves reached 92.59%, and the incidence after SA treatment decreased to 79.26%, and significantly increased the expression of disease-associated protein genesand. Compared with the wild type, the overexpression ofsignificantly increased the resistanceofleaves toThe incidence of wild typereached 77.5%, while the incidence of two transgeniclines was only 21.5% and 17.4%,and significantly increased the expression of,, andgenes associated with disease progression. The root growth ofplants with overexpression ofwas inhibited. after 7 days of culture, the length of main root of transgenicwas 39.9% and 43.1% respectively of that of wild type. after 10 days of culture, the length of main root of transgenicwas 58.5% and 55.4% respectively of that of wild type. The expression level of the auxin synthesis-related geneand auxin transport-related genesandwas significantly lower in theoverexpression lines than in the wild type.【Conclusion】The expression ofwas induced by the infection of SA and the pathogenic fungi.is an important disease resistance gene in apple. The overexpression ofsignificantly increased the resistance to.has the function of regulating the growth and development of plant roots, which may affect the growth and development of plant roots by down-regulating the expression of auxin transport-related genes.

apple;; salicylic acid (SA);; immune resistance; root growth

10.3864/j.issn.0578-1752.2018.21.005

2018-05-14；

2018-06-19

國家自然科學基金（31272132）、山東省泰山學者工程啟動基金（tshw20120712）、作物生物學國家重點實驗室導向性課題（dxkt201713）

周茜茜，E-mail：18763829703@163.com。通信作者吳樹敬，Tel：0538-8246220；E-mail：wushujing666@163.com。通信作者陳學森， Tel：0538-8249338；E-mail：chenxs@sdau.edu.cn

（責任編輯 岳梅）