五味子炮制品提取物對α-葡萄糖苷酶抑制作用的研究

謝曉燕

（長春中醫藥大學附屬醫院藥學部，吉林 長春 130021）

α-葡萄糖苷酶（AG）是維持人體正常代謝的重要酶，其通過催化水解糖內的 1，4糖苷鍵而水解麥芽糖及蔗糖等，在人體中廣泛分布，對機體的新陳代謝起到極為關鍵的作用[1]。五味子[2]為木蘭科植物五味子木蘭科植物五味子 Schisandra chinensis （Turcz.）Baill.的干燥成熟果實。本品益氣生津，補腎寧心，用于久咳虛喘，自汗，盜汗、遺精，滑精，久瀉不止，津傷口渴，內熱消渴，心悸失眠等癥。本研究在傳統中醫藥理論的指導下，優選五味子蒸制及醋制最佳炮制工藝，按照溶劑的極性差別依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、水進行各部位的提取，干燥得到八個有效部位。并采用體外試驗，建立α-葡萄糖苷酶活抑制劑篩選體系。為從我國傳統中藥資源中開發篩選高活性、結構明確、不良反應小的AGI類藥物的研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物：Wistar大鼠，體質量（200±20）g，動物合格證號：SCXK-（吉）2011-0004，購于長春市億斯實驗動物技術有限責任公司。

1.1.2 藥品與試劑：五味子提取物，棕褐色粉末，由長春中醫藥大學附屬醫院實驗中心提供，批號：20160526；8種提取物分別為蒸制炮制品石油醚提取（蒸/石），乙酸乙酯提取（蒸/乙）、正丁醇提取（蒸/正）、水提取（蒸/水），醋制炮制品石油醚提取（醋/石）、乙酸乙酯提取（醋/乙）、正丁醇提取（醋/正）、水提取（醋/水）；陽性對照藥：阿卡波糖（商品名：拜唐平），規格：50毫克/片，批號：160927，中國北京拜耳醫藥保健有限公司產品。

4-硝基酚-α-D-吡喃葡萄糖苷（pNPG），規格：純度＞99%，5克/瓶，美國 Sigma 公司產品；葡萄糖·H2O，規格：分析純，500克/瓶，批號：20151120，北京化工廠產品； Na2HPO4·12H2O，規格：分析純，500克/瓶，批號：20140306，北京化工廠產品；NaH2PO4·2H2O，規格：分析純，500克/瓶，批號：20151011，北京化工廠產品；葡萄糖試劑盒，批號：20150616，購于上海生物制品所；Na2CO3規格：規格：分析純，500克/瓶，批號：20150616，天津塘沽化學試劑廠產品。

1.1.3 主要儀器：酶標儀，勻漿機，萬分之一天平，高速冷凍離心機pH計。

1.2 方法

1.2.1 α-葡萄糖苷酶液的提取及活力測定：將大鼠處死，即刻取出小腸并清除內容物，加入4 ℃預冷PBS（質量體積比1∶3），勻漿，4 ℃條件下，8000 rpm離心20 min，分裝上清液，-20 ℃貯存備用。

取上清酶液0.1 mL加0.35 mL PBS，37 ℃水浴10 min，加入0.25 mol/L pNPG溶液0.05 mL，20 min，立即投入冰水浴中5 min，繼續加入Na2CO3溶液0.5 mL終止反應。葡萄糖試劑盒測定葡萄糖濃度，5孔平行測定。將在37 ℃、pH 6.8條件下，1 L溶液中每分鐘生成1 μmol葡萄糖定義為一個酶活力單位[3]。

1.2.2 體外抑制試驗：向48孔板中加入小腸酶液0.35 mL/孔，分別于各孔中加入0.1 mg/mL陽性藥或供試品（300 mg/mL）各0.1 mL，正常對照組中加入0.1 mL PBS代替供試品點樣，每組5孔平行加樣。再加入0.25 mol/L pNPG溶液0.05 mL，于37 ℃水浴中，反應20 min，立刻投入冰水浴中反應5 min，以降低酶活性，加入Na2CO3溶液0.5 mL終止反應。用葡萄糖試劑盒測定葡萄糖濃度，根據下列公式，計算抑制率[3]。

利用公式（1）計算葡萄糖濃度：

（校準濃度=5.55mmol/L）

根據公式（1），求出葡萄糖濃度。

1.3 數據處理：用SPSS18.0對數據進行統計分析，葡萄糖含量以均數±標準差（±s）表示，兩組間均數差異采用組間t檢驗，P＜0.05具有統計學差異。

2 結 果

2.1 大鼠小腸酶活力的測定。利用葡萄糖試劑盒測得：樣品管 A 值為0.2902，空白管A值為0.0528，校準管A 值為0.2514，根據（1，2）公式可得，樣品管中葡萄糖濃度值為1.195 mmol/L，酶活力值為119.5酶活力單位。

2.2 供試品體外抑制實驗：阿卡波糖對 AG的抑制率優于蒸五味子和醋五味子，蒸五味子和醋五味子對AG均有抑制作用，與正常對照組相比，蒸/石、醋/石組（P＞0.05）的葡萄糖濃度無明顯差異；而蒸/乙（P＜0.05）、醋/乙（P＜0.01）、蒸/正（P＜0.001）、醋/正（P＜0.001）、蒸/水（P＜0.001）、醋/水（P＜0.001）等組生成的葡萄糖濃度均非常明顯的低于正常對照組。從各組的抑制率可以看出，供試品對AG的抑制作用隨著提取溶劑的極性增大而明顯增強。

3 討 論

五味子針對糖尿病的治療療效顯著，本實驗旨在進一步研究五味子及其炮制品中具有降血糖作用成分的研究，提高五味子有效成分在臨床上的利用，降低非有效成分在應用中不良反應的發生率。隨著人們飲食結構及生活環境的改變，糖尿病發生率逐年升高，其治療費用隨之迅速增加，成為當代醫學面臨的嚴重問題之一。本研究采用體外AGI篩選體系，優選五味子降糖有效成分，并對醋五味子、蒸五味子的極性梯度提取產物進行AGI抑制作用的比較，通過體外實驗，我們發現，蒸制和醋制五味子的水提取物和正丁醇提取物有明顯的降糖作用，而乙酸乙酯和石油醚提取物也具有一定降糖作用，但不是很明顯。實驗結果表明，五味子及其炮制品提取物對AG的抑制作用隨著提取溶劑極性的增大而增強，按照相似相溶原理，說明五味子中AGI有效成分為極性較強的化合物。將醋制五味子的提取物與相同溶劑的蒸制提取物相比較后，我們發現，醋制的正丁醇和水提取物的AGI活性要明顯強于蒸制提取物（分別為 △P＜0.05，△△P＜0.01）。傳統中醫理論認為[4-5]，消渴（糖尿病）的病機為陰津虧損，燥熱偏盛，而以陰虛為本，燥熱為標，二者互為因果，陰愈虛則燥熱愈盛，燥熱愈盛則陰愈虛，消渴病變的臟腑尤以腎最為重要。五味子經過醋制后，其收斂作用增強，多用于肝腎虧損之證，其理化性質在炮制前后會有明顯的差異，進而導致其相關成分的AGI藥理活性明顯增強。

本研究通過體外實驗說明，五味子的水提取物和正丁醇提取物主要發揮降低AG活性的作用，而通過醋制，則可進一步增強其正丁醇和水提物的AGI活性。五味子醋制品對AG的抑制機制與傳統的中醫藥病機分析相符，這為從我國傳統中藥資源中開發篩選高活性、結構明確、不良反應小的AGI類藥物以及中藥現代化的研究奠定了良好的基礎。