蟾毒靈聯(lián)合組蛋白脫乙酰酶抑制劑SAHA抗多發(fā)性骨髓瘤細胞的效應

黃河，周舒萍，郭文堅，姚榮欣，林穎

（溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院 血液腫瘤科，浙江 溫州 325027）

多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）是漿細胞惡性增殖性疾病，其發(fā)病率占所有腫瘤的1%和血液系統(tǒng)腫瘤的13%[1]。由于新藥的不斷出現(xiàn)，使MM在治療療效方面進展迅速，但是總體療效仍不甚滿意，特別是高危患者在很短的時間內(nèi)就會復發(fā)[2-3]。組蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase，HDAC）是抗腫瘤藥物的一個靶點，具有選擇性的HDAC抑制劑已經(jīng)成為抗腫瘤藥物研究的熱門領域。本研究中的藥物SAHA（vorinostat）是一種I和I I類HDAC抑制劑，目前該藥已臨床應用于治療MM[4-5]。而蟾毒靈（bufalin）是一種從中華大蟾蜍（亞洲蟾蜍）的毒液蟾酥中分離出來的類固醇強心劑，其在血液系統(tǒng)腫瘤中的抗腫瘤效應已有許多重要成果[6-8]。在此基礎上，本課題組對以上2種藥物在MM中的抗腫瘤作用進行了研究，以期為藥物的臨床應用提供參考，為疾病的治療提供新思路。

1 材料和方法

1.1 材料 胎牛血清（美國Gibco公司）；RPMI-1640培養(yǎng)基、碘化丙啶（propodium iodide，PI）（美國Sigma公司）；CCK-8試劑盒、羅丹明RH-123熒光染料（日本Dojindo公司）；化合物蟾毒靈（上海同田生物技術公司）；SAHA（上海默克公司）。人MM細胞株H929、U266、RPMI8226細胞購于美國ATCC細胞庫，細胞株CZ-1受贈于上海長征醫(yī)院。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)：本研究采用的人MM細胞株在含10%胎牛血清、100 μg/mL青霉素，100 μg/mL鏈霉素和2 mmol/mL谷氨酰胺的RPMI-1640培養(yǎng)液中常規(guī)培養(yǎng)（37 ℃，5% CO2）。用于實驗的細胞保持在對數(shù)增長期。

1.2.2 CCK-8檢測細胞毒性：細胞接種于96孔板中，每組設3個復孔，每孔接種10000個細胞，加入不同濃度藥物刺激（蟾毒靈：0、2.5、5、10、20、40 nmol/L濃度分別與H929、U266、CZ-1細胞培養(yǎng)；SAHA：0、1.25、2.5 μg/mL濃度分別與H929、CZ-1細胞培養(yǎng)；藥物聯(lián)合培養(yǎng)組：10 nmol/L蟾毒靈單藥，或分別與0、0.25、0.5、1.0 mmol/L SAHA與H929細胞培養(yǎng)）。細胞培養(yǎng)48 h后，每孔200 μL終體積中加入10 μL CCK-8試劑，細胞培養(yǎng)條件下孵育3～5 h后，用酶標儀測定450 nm處吸光度（A）值，按以下公式計算藥物對細胞的增殖抑制情況：細胞增殖活性（%）=A藥物組/A對照組×100%。統(tǒng)計各處理組與對照組活細胞吸光度值，計算細胞的生長活性或抑制率。各實驗均重復3次。

1.2.3 細胞跨膜電位損傷檢測：羅丹明RH-123是一種親脂性陽離子熒光染料，并且能順利通過活細胞的細胞膜和線粒體膜，可以選擇性地富集于線粒體上。用該染色方法，去檢測藥物作用后骨髓瘤細胞跨膜電位損傷情況。富集于線粒體上的RH-123隨線粒體跨膜電位的變化而變化，所以測定線粒體上RH-123的熒光強度可以反映線粒體的膜電位的變化情況。收集2×105細胞，PBS洗1次，加入200 μL 1×結(jié)合緩沖液重懸細胞，RH-123用去離子水制成1 mg/mL的儲存液存于-20 ℃。在待測細胞中加入RH-123，使其終濃度為10 μg/mL。搖床37 ℃孵育30 min、收集細胞，PBS緩沖液離心洗滌細胞，2000 r/min，10 min，去除沒有結(jié)合的染料；100 μL PBS重懸細胞，加入80 μL的PI，混勻后，室溫下避光靜置15 min，再加入400 μL PBS緩沖液，上流式機488 nm激發(fā)，F(xiàn)L1-H、FH2-H熒光通道分別收集熒光信號檢測。

1.2.4 細胞周期分析：按2×106細胞密度，分別收集12、24、48 h蟾毒靈作用下的MM細胞，用PBS洗1次后加入75%的乙醇在-20 ℃冰箱固定過夜，離心收集細胞，用PBS洗2次，加入10 μL RNA酶（100 mg/mL）37 ℃消化30 min；加入100 μL PI（250 μg/mL）染色后流式細胞儀檢測分析。

1.3 統(tǒng)計學處理方法 本研究所有數(shù)據(jù)均重復至少3次并且確認一致結(jié)果后，采用SPSS11.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料采用±s形式表示，Student’s-t檢驗分析2組間的差異。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 蟾毒靈抑制MM細胞增殖 MM細胞H929、U266、CZ-1，分別經(jīng)0、2.5、5、10、20、40 nmol/L蟾毒靈處理48 h，用CCK-8試劑盒檢測發(fā)現(xiàn)藥物可顯著地抑制細胞的增殖，并呈濃度依賴性。且蟾毒靈在H929、U266及CZ-1細胞中的半數(shù)抑制濃度（IC50）值為10～20 nmol/L（見圖1）。

圖1 蟾毒靈呈劑量依賴性抑制MM細胞增殖

2.2 蟾毒靈引起MM細胞發(fā)生細胞周期阻滯 為明確藥物對細胞生長情況的影響，我們進行了細胞周期的分析。將經(jīng)20 nmol/L蟾毒靈作用24、48 h后的H929、U266及RPMI8226細胞收集、固定、RNA酶消化及PI染色后流式檢驗發(fā)現(xiàn)，與DMSO處理的對照組比較，蟾毒靈處理的細胞在24 h時S期及G2-M期的細胞增多，48 h時G2-M期阻滯的細胞進一步增多（見圖2），證明蟾毒靈誘導這3株MM細胞發(fā)生S期及G2-M期的細胞周期阻滯。

圖2 蟾毒靈引起MM細胞發(fā)生細胞周期阻滯

2.3 蟾毒靈誘導MM細胞凋亡 線粒體跨膜電位下調(diào)是細胞凋亡早期的標志性事件，測定線粒體上RH-123的熒光強度可以反映線粒體的膜電位的變化情況；并且，我們用PI對細胞進行雙染，以區(qū)分壞死細胞與凋亡細胞。經(jīng)20 nmol/L蟾毒靈處理H929、U266細胞48 h后，用Rh123染色后流式細胞儀檢測細胞的膜電位變化。如圖3結(jié)果顯示，對照組RH-123陰性細胞比例分別為H929（8.99%±0.38%）和U266（7.41%±1.51%），藥物作用后細胞內(nèi)線粒體跨膜電位即出現(xiàn)下降，RH123陰性細胞比例分別增加為（18.66%±1.06%）和（30.81%±0.40%）。該結(jié)果提示蟾毒靈可通過引起細胞內(nèi)線粒體的損傷而導致細胞凋亡的發(fā)生。

2.4 SAHA抑制MM細胞增殖 分別用0、1.25、2.5 mmol/L SAHA處理H929、CZ-1細胞48 h，用CCK-8分析發(fā)現(xiàn)，與用DMSO處理的對照組相比，1.25 mmol/L SAHA即可顯著抑制上述細胞的增殖（P＜0.05），相應的生長抑制率為59.52%±2.91%，45.09%±1.96%（見圖4）。

圖3 Rh-123染色實驗提示細胞線粒體跨膜電位損傷

2.5 蟾毒靈與SAHA聯(lián)合作用MM細胞株H929 用10 nmol/L蟾毒靈單藥，或分別與0、0.25、0.5、1.0 mmol/L SAHA聯(lián)合處理H929細胞48 h，經(jīng)CCK-8分析顯示，10 nmol/L的蟾毒靈顯著加強SAHA抑制MM細胞生長的作用，使相應濃度作用下的細胞生長活性進一步下降（見圖5），在0.25 mmol/L濃度時從85.35%±4.31%到50.25%±2.75%，0.5 mmol/L濃度時從74.49%±3.55%到42.08%±0.44%，1.0 mmol/L濃度時從58.13%±4.34%到33.77%±0.91%，較單藥有顯著的抗MM作用（P＜0.01）。

3 討論

圖5 蟾毒靈和SAHA聯(lián)合抑制H929細胞增殖

MM被認為是一種進行性與不可治愈性的疾病，針對該疾病的藥物開發(fā)非常必要。本研究發(fā)現(xiàn)來自于我國傳統(tǒng)中藥蟾酥的蟾毒靈，能夠在較低濃度抑制MM細胞增殖并誘導其凋亡；過往研究發(fā)現(xiàn)蟾毒靈可以通過直接靶向聚腺苷酸二磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶1[poly（ADP-ribose）polymerase-1，PARP-1]，從而抑制細胞DNA的損傷修復[8]。HDAC可降低組蛋白乙酰化，引起DNA組蛋白復合物壓縮，從而阻礙基因轉(zhuǎn)錄，促進腫瘤細胞生長停滯、分化及凋亡，而對正常細胞幾乎沒有影響[9]。HDAC抑制劑可以解除DNA組蛋白復合物壓縮，從而達到抗腫瘤的效果。SAHA是一種廣譜的HDAC抑制劑，它可以通過引起核心組蛋白乙酰化的累積，誘導MM細胞凋亡，特別是引起耐藥腫瘤細胞凋亡。結(jié)合SAHA的抗腫瘤作用機制也是與DNA的損傷修復相關，本研究首先證實了蟾毒靈顯著地抗MM效應，在較低的藥物濃度水平就可抑制人MM細胞的增殖，并且引起細胞生長阻滯于S及G2-M期，同時誘導細胞凋亡；并且蟾毒靈與SAHA聯(lián)合可以顯著地提高藥物的毒性作用，較低藥物濃度短時相就可誘導MM細胞凋亡。

SAHA可加強地塞米松、來那度胺的抗腫瘤作用，與硼替佐米等蛋白酶體抑制劑的合用在許多耐藥及晚期的MM患者中都有明顯的療效[10]。MITSIADES等[11]的研究認為，SAHA抗MM作用，與它可使P21、P53蛋白的表達水平升高，抗凋亡蛋白的表達下調(diào)，以及蛋白酶體及其亞基的活化受阻相關。本研究僅在細胞水平上證實了蟾毒靈與SAHA的聯(lián)合抗MM作用，但是其深入的分子生物學作用機制仍需探索，而DNA修復相關的分子作用途徑可能存在著主要作用；同時兩藥是否存在協(xié)同效應也需要進一步的研究證實。