環狀RNA（circRNA）在肝細胞癌中的研究進展（綜述）

方安寧 周衛鳳 嚴家來

環狀RNA分子（circRNA）是一類特殊的長鏈非編碼RNA (lncRNA)，其獨特的環狀結構使其能夠逃逸RNase酶的降解，具有很強的胞內穩定性。最初研究認為是由 RNA 錯誤剪接形成，但目前研究認為circRNA具有充當微小RNA（miRNA）的分子“海綿”，調控親本基因表達以及剪接和轉錄等功能。且在疾病的發生和發展中發揮重要作用，可能作為新的生物標記物。circRNA在人體組織表達具有組織特異性，研究發現有多種circRNA與肝癌相關（如hsa_circ_0001649、circZKSCAN1等）并在肝細胞癌（HCC）上發揮重要作用，且目前關于circRNA的研究才剛開始，本研究旨在尋找HCC中差異表達的circRNA，探究部分差異表達的circRNA在HCC中的作用及其功能機制，為肝癌的早診斷和早治療提供新的方向和理論依據。

1 肝癌診斷治療中存在問題

肝細胞癌（HCC）是我國最常見的惡性腫瘤之一，其病死率位居惡性腫瘤第三[1]，嚴重威脅我國國民經濟的發展和人口健康。肝細胞癌的發生與乙型肝炎密切相關，而乙型肝炎發病率在我國較高。目前，外科手術、放化療、肝移植是治療肝癌的主要手段，但由于該病發病隱匿，雖然甲胎蛋白（AFP）用于診斷HCC已被廣泛認可，據文獻[2～3]報道，AFP在診斷和監測 HCC 的局限性，即按照目前HCC的診斷標準，當AFP和影像學檢查結果異常時，已發展到晚期，大多數患者已經失去了寶貴的早期干預和治療的機會。所以 HCC總體預后較差，因此，如何發現早期分子標志物，開發特異性的靶向藥已經成為研究的重點和難點。

臨床上已經應用的HCC輔助診斷的標志物除了AFP還有AFP的異構體比例（AFP-L3%）、人磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（GPC3）及去γ-羥基凝血素（DCP）。其他已報道的標志物還有高爾基磷酸化蛋白（GOLPH2/GP73）、肝癌癌蛋白（p28GANK）、α-L-巖藻糖苷酶（AFU）、鱗狀上皮細胞癌抗原（SCCA）和肝細胞生長因子（HGF）等，即使上述潛在標志物的聯合應用，對于HCC診斷的敏感性也不能達到作為理想標志物的標準，從而失去最佳手術機會。因此，尋找肝癌早期新的診斷標志物和治療靶點很有必要。

2 環狀RNA可能應用于肝癌診斷的研究進展

基于人們普遍認為抑癌基因的異常失活或癌基因的激活是導致肝癌發生的主要原因，越來越多的研究發現circRNA參與細胞的各項生命活動，且腫瘤細胞與癌旁組織來源細胞間circRNA表達譜具有明顯差異并與腫瘤的發生和發展密切相關，circRNA或將成為新一代的生物標志物或治療靶點，應用于人類疾病診斷、治療、組織發育鑒定等多個方面的研究。

circRNA是一種新興的內源性非編碼 RNA(ncRNA)，具有高度保守序列，是基因表達的調控因子，有潛力在轉錄和轉錄后發揮重要作用。在最近幾年逐漸受到廣泛關注，是目前RNA研究的熱點。通過外顯子的環化或內含子的環化可以將3'和5'末端連接起來形成完整的環狀結構（圖1），剪接體（splicesome）切除兩組環狀模型中剩余的內含子，形成circRNA后經核孔復合體運輸至胞質，且外顯子circRNA與內含子circRNA分別具有脫支酶與RNA外切酶抗性[4]。比線性RNA（linear RNA，含5'和3'末端）具有更穩定，更強的保守性[5]，可以在生物體中以多種類型大量存在[6]。大多數由外顯子形成，定位于細胞質，具有組織/發育階段特異性表達[7]。人血液樣本中circRNA可檢測，且比相對應的線性mRNA高表達[8]，因此具有腫瘤標志物的可能性。近年來越來越多的研究者發現，circRNA在基因表達調控中的mRNA前體線性剪接競爭，還可以調節親代基因表達，這豐富了人們對內源性非編碼RNA的認識，提示circRNA在臨床診斷和治療方面具有廣闊的前景。

圖1 circRNA形成的可能機制

2.1 circRNA的作用機制 circRNA可作為微小 RNA（miRNA）分子“海綿”（sponge）發揮作用。Hansen TB等[9]于2011年首次發現小腦退化相關蛋白1反義轉錄物（CDR1as）是一種與多種癌癥和神經性疾病的發生相關的環狀RNA分子。2013年，Memczak S等[10]發 現Cdr1as具 有 充當microRNA“海綿”的潛能，它具有超過60個miR-7（一種microRNA）的結合位點。2017年，中國科學院葛峰研究組成功構建了CDR1as在肝癌細胞中的蛋白調控網絡。其含有74個 miR-7的miRNA 應答原件（MRE），可通過吸附作用充當miRNA的抑制劑，其負調控作用明顯強于線性RNA分子“海綿”。Y染色體性別決定基因（SRY）相關的睪丸特異性 circRNA 是另一種具有代表性 的miRNA分 子“ 海 綿 ”，包 含16個miR138的MRE，可反向調控其表達水平[9]。此外三種類型的circRNA調控基因表達：①circRNA (僅有內含子)與pol Ⅱ結合促進基因轉錄。②EIciRNA（含有內含子和外顯子）與小核糖體U1snRNP結合形成復合體進一步與RNA聚合酶Ⅱ結合促進親本基因轉錄[11]。③ circRNA（僅含外顯子序列）含有miRNA結合位點元件（MRE）可吸附miRNA間接調控mRNA表達（圖2）。

圖2 circRNA可能的作用機制

2.2 circRNA與腫瘤 基于circRNA的miRNA分子“海綿”作用的表達與多種疾病的發生發展相關，在病理樣本中可以觀察到顯著的表達差異。Horsham JL等[12]研究表明miR-7 在神經系統疾病、糖尿病以及多種腫瘤中發揮重要作用。除miR-7外，circRNA還被發現在疾病中與其他miRNA相互作用[13]，且在疾病中存在明顯的表達差異。特別是circRNA在腫瘤發生發展中的作用，有大量實驗表明circRNA與食管鱗狀細胞癌、基底細胞癌、結腸癌、卵巢癌及乳腺癌中表達異常，可以作為一種腫瘤標志物。

Qin M等[14]研究表明，circRNA“hsa_circ_0001649”在肝細胞癌中的表達明顯下調，Shang X等[15]通過比較肝癌組織和癌旁組織中差異表達的circRNA得出hsa_circ_0005075可能成為肝細胞癌的一種潛在的生物標記物，在腫瘤的發生與遷移中發揮作用。circRNA-100338/miR-143-3p通路在乙型肝炎病毒（HBV）相關的肝癌組織中高表達且與患者生存率和轉移相關[16]。低表達的Has_circ_0004018與血清AFP及患者肝癌分期有關[17]。ZKSCAN1 mRNA與circZKSCAN1在肝癌患者中低表達，敲低后能促進細胞擴增、轉移和侵入，相反過表達能抑制[18]。線性的miRNA海綿比circRNA有較多的結合位點和高的表達水平，可能在隔絕 miRNA方面更有效[19]。

目前相對于miRNA及LncRNAs，circRNA是新的研究熱點，其在肝癌組織中差異表達的報道非常少，其與miRNA-mRNA間作用機制以及在臨床診斷中應用還須做大量探索研究工作。