骨橋蛋白及炎性因子在輕度認(rèn)知障礙進(jìn)展的預(yù)測價值研究

劉婷，李丹，張燕，孟新玲

本研究創(chuàng)新點(diǎn)：

骨橋蛋白（osteopontin，OPN）是一種炎性因子，在各種慢性炎癥和自身免疫疾病中發(fā)揮重要作用。既往的體內(nèi)和體外實(shí)驗表明OPN表達(dá)增強(qiáng)很可能是應(yīng)對加速的神經(jīng)退行性變和病理性變化時的反應(yīng)。但有關(guān)結(jié)果多局限在動物實(shí)驗階段，臨床上確切的炎癥致病機(jī)制尚未完全明確。輕度認(rèn)知障礙（MCI）被認(rèn)為是介于認(rèn)知正常和癡呆之間的一種疾病。有關(guān)早期識別進(jìn)展為AD的MCI患者的潛在生物標(biāo)記物研究較少，通過尋找血清和腦脊液中對MCI和癡呆診斷、預(yù)警有幫助的蛋白標(biāo)志物是全世界學(xué)者追求的目標(biāo)。因此，本研究創(chuàng)新點(diǎn)在于從嶄新的角度探索AD臨床前期和疾病早期新的生物學(xué)標(biāo)志，探索AD不同時期、不同認(rèn)知功能狀態(tài)下OPN及相關(guān)細(xì)胞因子的變化，為AD的篩查、預(yù)警和早期診斷提供客觀依據(jù)，為AD治療藥物的選擇提供一定的參考，并且為AD的治療效果評價提供客觀指標(biāo)。

阿爾茨海默?。ˋD）是一種常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，其特征是慢性進(jìn)行性認(rèn)知功能衰退［1］。輕度認(rèn)知障礙（MCI）被認(rèn)為是介于老年人認(rèn)知正常和癡呆之間的一種疾病。一部分患有MCI的個體可能進(jìn)展為AD，并具有典型癡呆的生物學(xué)變化［2］。

迄今為止，AD中神經(jīng)元和突觸變性的潛在機(jī)制仍未十分清楚，但炎癥過程和免疫失調(diào)參與其發(fā)病機(jī)制的理論已被廣泛證實(shí)。神經(jīng)病理學(xué)和神經(jīng)放射學(xué)研究表明，AD腦中的炎性變化是相對早期的致病事件，早于神經(jīng)的破壞過程［3-4］。但是目前用于早期識別進(jìn)展為AD的MCI和不進(jìn)展的MCI的生物標(biāo)志物較少。因此，本研究擬通過對骨橋蛋白（OPN）及細(xì)胞炎性因子的研究尋找潛在的生物標(biāo)志物，為評估OPN以及炎性因子在MCI患者進(jìn)展為AD中的預(yù)測價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 前瞻性分析2015年6月—2017年6月新疆維吾爾自治區(qū)中醫(yī)醫(yī)院腦病一科收治的MCI患者以及年齡、性別相匹配的非炎癥性神經(jīng)病變（OND）患者，各60例?；颊呔杉覍俸炇鹬橥鈺⑼ㄟ^醫(yī)院倫理委員會審查。

納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）結(jié)合臨床表現(xiàn)及影像學(xué)檢查明確診斷為MCI或OND；（2）年齡≥50歲；（3）既往無腫瘤及精神疾病等病史；（4）視聽功能完好，可完成記憶量表檢測，無認(rèn)知功能障礙；（5）簽署知情同意書。MCI的診斷標(biāo)準(zhǔn)是指：（1）主訴記憶障礙，而且有知情者證實(shí)；（2）總體認(rèn)知功能正常，但有某一認(rèn)知方面的變化；（3）日常生活能力正常，可能會影響社會活動、人際交往、工作能力、家庭生活；（4）未達(dá)到癡呆的診斷標(biāo)準(zhǔn)；（5）排除癡呆和其他可引起腦功能障礙的內(nèi)科或精神心理癥狀［5］。OND是指由非炎癥性因素引起的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，如神經(jīng)性頭痛等。

排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）入院時患精神病或神經(jīng)障礙，顱腦損傷導(dǎo)致的意識喪失，酒精或藥物濫用；（2）伴隨可能影響免疫水平疾病，如糖尿病、嚴(yán)重的肺炎、自身免疫性疾病、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、急性或慢性炎癥疾病等；（3）伴隨重大軀體疾病并危及生命，如急性心肌梗死、嚴(yán)重慢性阻塞性肺疾?。唬?）抽血化驗期間使用皮質(zhì)類固醇激素及非甾體類抗炎藥物；（5）拒絕簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 收集基線資料 患者入院后收集以下臨床數(shù)據(jù)資料，包括性別、年齡、體質(zhì)指數(shù)（BMI）、簡易智能量表（MMSE）評分。MMSE是一種認(rèn)知篩查工具，用于評估時間和空間定位、記憶力、注意力、計算、語言和視覺能力。由20個問題共30項組成，最高得分為30分。文化程度為文盲＜17分、小學(xué)＜20分、中學(xué)以上＜24分為癡呆。入院患者常規(guī)行腰椎穿刺留取腦脊液標(biāo)本，晨起空腹抽取肘靜脈血5 ml，以3 000 r/min離心10 min，離心半徑150 mm，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測腦脊液和血清OPN水平（R＆D公司，美國）、血清白介素（IL）-1β、IL-6、IL-17A、轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）-β1、腫瘤壞死因子（TNF）-α和IL-4水平（R＆D公司，美國），作為患者的基線數(shù)值。

1.2.2 隨訪 所有患者主要通過門診和住院隨訪1年，隨訪截止日期為2018-06-01，對失訪病例按最后1次隨訪時間為準(zhǔn)做刪失處理。

1.2.3 分組方法 根據(jù)患者的診斷在隨訪結(jié)束時分為AD組、未進(jìn)展組和OND組。當(dāng)AD組診斷為AD時再次按照上述方法測量腦脊液和血清中OPN及各炎性細(xì)胞因子水平。對比分析各組隨訪前后的差異，以及MMSE評分、OPN以及各炎性細(xì)胞因子的相關(guān)性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以（±s）表示，多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用q檢驗；計數(shù)資料的分析采用χ2檢驗；采用Pearson相關(guān)進(jìn)行相關(guān)性分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般臨床資料 隨訪1年后，MCI患者中有23例發(fā)展為AD，5例失訪；OND患者中有9例失訪。最終AD組23例，未進(jìn)展組32例，OND組51例。

入院時，3組性別、年齡、BMI、MMSE評分、血清 OPN、IL-1β、IL-6、IL-17A、TNF-α、TGF-β1和IL-4水平比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；入院時3組腦脊液OPN水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；其中AD組腦脊液OPN水平高于未進(jìn)展組和OND組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

隨 訪 1年 時，3組 IL-1β、IL-6、IL-17A、TGF-β1、IL-4水平比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；隨訪1年時3組血清OPN、TNF-α水平比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；其中AD組血清OPN、TNF-α水平均高于未進(jìn)展組和OND組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，見表1）。

2.2 相關(guān)性分析 相關(guān)性分析結(jié)果顯示，所有入組患者在入院時腦脊液OPN水平與MMSE評分呈正相關(guān)（r=0.348，P＜0.001，見圖1）。血清 OPN水平與MMSE評分呈正相關(guān)（r=0.631，P＜0.001，見圖2）。血清TNF-α水平與MMSE評分呈負(fù)相關(guān)（r=-0.435，P＜0.001，見圖 3）。

2.3 隨訪1年后各項炎性因子變化結(jié)果 AD組患者入院時、診斷AD時、隨訪1年時IL-1β、IL-6、IL-17A、TNF-α、TGF-β1、IL-4水平比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；AD組患者入院時、診斷AD時、隨訪1年時MMSE評分、腦脊液OPN、血清OPN水平比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）；其中診斷AD時、隨訪1年時MMSE評分低于入院時，腦脊液OPN、血清OPN水平高于入院時，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，見表2）。

圖1 腦脊液OPN水平與MMSE評分的相關(guān)性分析Figure 1 Correlation analysis of CSF OPN level and MMSE score

表1 兩組臨床資料比較Table 1 Comparison of general data between the two groups

3 討論

MCI被認(rèn)為是介于認(rèn)知正常和癡呆之間的一種疾病。一部分患有MCI的個體會進(jìn)展為AD，并具有典型癡呆的生物學(xué)變化［2］。研究表明MCI患者的腦脊液和血清中含有多種促炎物質(zhì)，如細(xì)胞因子、急性期蛋白和補(bǔ)體蛋白，其在誘導(dǎo)認(rèn)知衰退、記憶喪失和癡呆中起著重要作用［6-7］。其中OPN已經(jīng)被證實(shí)可以通過多種機(jī)制在慢性炎癥和自身免疫疾病的進(jìn)展中發(fā)揮作用，包括參與產(chǎn)生Th1和Th17等炎癥疾病的致病性T細(xì)胞［8-9］，以及與其受體（如CD44等）相結(jié)合抑制自身反應(yīng)性免疫細(xì)胞的凋亡和白細(xì)胞向炎癥部位遷移和黏附而發(fā)揮抗炎作用［10］。但是目前用于早期識別進(jìn)展為AD的MCI和不進(jìn)展MCI的臨床標(biāo)志物很少。因此，本研究擬通過對OPN以及炎性細(xì)胞因子的研究尋找潛在的生物標(biāo)志物。

圖2 血清OPN水平與MMSE評分的相關(guān)性分析Figure 2 Correlation analysis of serum OPN level and MMSE scores

圖3 血清TNF-α水平與MMSE評分的相關(guān)性分析Figure 3 Correlation between serum TNF-α level and MMSE scores

注：與入院時比較，aP＜0.05

本研究橫向研究顯示，在入院時僅腦脊液OPN水平在AD組中顯著升高，在未進(jìn)展的MCI組與OND組無顯著性差異。但當(dāng)AD組隨訪1年后腦脊液OPN和血清OPN水平、TNF-α水平均高于入院基線值。分析認(rèn)為由于剛診斷為AD時，炎性反應(yīng)主要發(fā)生在腦的脆弱區(qū)域，如內(nèi)嗅、顳頂葉和扣帶回皮質(zhì)，引起急性期蛋白和促炎遞質(zhì)的表達(dá)增加。而腦脊液內(nèi)的炎性因子可以直接接觸大腦，能準(zhǔn)確反映中樞神經(jīng)系統(tǒng)正在進(jìn)行的炎癥過程［11］。因此與血清OPN相比，腦脊液OPN水平在發(fā)生認(rèn)知功能下降前已經(jīng)發(fā)生變化。此外本研究還發(fā)現(xiàn)其他炎性因子在各組之間均無顯著差異，與既往研究相似［12］。何璐等［12］進(jìn)行的70種免疫及炎癥相關(guān)蛋白研究也證實(shí)，除TNF-α外，AD組和健康對照組IL-1β、IL-4、IL-6、IL-17A等常見的炎性細(xì)胞因子相比無顯著差異。但也有研究和薈萃分析顯示，AD患者外周血中IL-6、IL-8、IL-10水平高于健康對照者［13-15］?？赡苁且驗楸狙芯恐信懦龢?biāo)準(zhǔn)較為嚴(yán)苛，嚴(yán)格排除了AD以外其他可能影響免疫炎癥水平的各種相關(guān)伴隨疾病。因此認(rèn)為MCI患者進(jìn)展為AD時，并不是所有的促炎因子和抗炎因子均發(fā)生改變。相關(guān)性分析也證實(shí)，腦脊液OPN水平和血清OPN水平、TNF-α水平均與癡呆嚴(yán)重程度具有相關(guān)性。研究認(rèn)為當(dāng)發(fā)生感染、炎性疾病、局部缺血和創(chuàng)傷性損傷等中樞神經(jīng)系統(tǒng)病理過程時，會刺激腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞釋放大量的炎性因子［16］，并且對AD患者死亡后的大腦分析發(fā)現(xiàn)TNF-α 可以定位在淀粉樣斑塊中［17］。COMI等［18］也證實(shí)在MMSE評分＞23分的AD患者中腦脊液OPN含量高于MMSE評分≤23分，與認(rèn)知功能下降有關(guān)。盡管OPN作為AD患者認(rèn)知功能減退的關(guān)鍵促炎細(xì)胞因子的確切作用及其潛在機(jī)制尚不清楚，但既往研究發(fā)現(xiàn)與健康對照者和未進(jìn)展的MCI患者相比，進(jìn)展為AD的MCI患者的腦脊液中OPN的磷酸化C末端片段增加［19］。為確定AD癥狀前階段的蛋白質(zhì)變化，有學(xué)者利用高分辨率液相色譜質(zhì)譜對家族性AD患者或有遺傳危險者的腦脊液進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析，結(jié)果表明，家族性AD突變載體的腦脊液OPN較相關(guān)非載體升高，提示臨床癡呆前腦脊液OPN發(fā)生變化［20］。在進(jìn)展為AD的MCI患者的腦脊液中，不僅OPN的完整形式增加，而且OPN的裂解形式也增加［21］。

本研究縱向隨訪研究顯示隨訪1年后，AD組MMSE評分無顯著變化，腦脊液和血清OPN水平、TNF-α水平均較診斷為AD時無顯著變化。這與JULIAN等［22］進(jìn)行的一項為期2年的隨訪研究相似，研究顯示AD患者隨訪期間未發(fā)現(xiàn)任何急性或慢性炎癥狀態(tài)，各項炎性因子亦無顯著差異。分析認(rèn)為可能是與OPN在神經(jīng)退行性疾病的發(fā)展過程中的兩種相反作用共同作用導(dǎo)致。一方面，OPN通過上調(diào)髓鞘形成和再髓鞘形成發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)劑的作用。另一方面，OPN通過引起神經(jīng)元毒性和死亡而具有疾病加速作用。隨著疾病進(jìn)程和嚴(yán)重程度發(fā)揮不同的作用［23-24］。

結(jié)合既往研究和本研究結(jié)果均提示腦脊液OPN是一種潛在早期評估MCI進(jìn)展的生物學(xué)標(biāo)志物，在AD的病理生理機(jī)制中發(fā)揮重要作用。本研究缺陷在于，首先由于為單中心研究，在排除標(biāo)準(zhǔn)上限制了大量會影響免疫功能的伴隨疾病，以及部分患者在隨訪期間資料不全，與其他研究相比1年后進(jìn)展為AD的比率偏高，仍需進(jìn)一步多中心前瞻性研究證實(shí)該結(jié)論。其次，本研究僅評估了少量炎性細(xì)胞因子的變化情況，由于檢測指標(biāo)和平臺的差異，還需進(jìn)一步大樣本研究發(fā)現(xiàn)更多的預(yù)測標(biāo)志物。最后，本研究隨訪1年后未能收集未進(jìn)展MCI組腦脊液中OPN變化情況，因此仍需進(jìn)一步研究證實(shí)該結(jié)論。

總之，腦脊液OPN水平是早期識別進(jìn)展為AD的MCI患者的潛在生物標(biāo)志物。并且血清及腦脊液OPN水平以及TNF-α水平與AD的嚴(yán)重程度具有相關(guān)性，但對于其他炎性因子與AD病情嚴(yán)重程度的關(guān)系仍有待于進(jìn)一步研究。

作者貢獻(xiàn)：劉婷、孟新玲進(jìn)行文章的構(gòu)思與設(shè)計、研究的實(shí)施與可行性分析；劉婷進(jìn)行數(shù)據(jù)收集、結(jié)果的分析與解釋、撰寫論文、進(jìn)行論文的修訂；劉婷、張燕進(jìn)行數(shù)據(jù)整理；李丹、張燕進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理；孟新玲負(fù)責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校、對文章整體負(fù)責(zé)，監(jiān)督管理。

本文無利益沖突。