羅氏全自動電化學發光免疫分析系統檢測大小鼠甲狀腺激素水平的實驗研究

王紅，王冉冉，趙得發，單忠艷，滕衛平，滕曉春

甲狀腺疾病是常見的內分泌疾病之一，其患病率高，發病機制復雜［1-2］。目前關于甲狀腺疾病的基礎研究越來越受到重視，檢測血清甲狀腺激素水平是評估機體甲狀腺功能狀態的常用方法，在基礎研究中廣泛應用。甲狀腺激素水平的測定主要有兩種方法：一是高效液相色譜串聯質譜法，其結果最為可靠，是檢測甲狀腺激素的金標準，但是價格昂貴，很難在實際研究中推廣；二是免疫法，包括放射免疫法、酶聯免疫法、化學發光免疫分析法等。放射免疫法靈敏度高，但因其有放射性污染、試劑有效使用期短等缺點，正在逐漸被非同位素標記法代替。酶聯免疫法測定嚙齒類動物甲狀腺激素水平技術不成熟，目前市售的針對大、小鼠甲狀腺激素水平測定的酶聯免疫試劑盒，由于其檢測誤差很大，不被學界認可。化學發光免疫分析法是人類甲狀腺激素測定的主要方法，其具有速度快、重復性好等優點，但目前國際上并沒有針對大、小鼠特異性的甲狀腺激素水平測定的電化學發光試劑盒。本研究旨在探討利用羅氏全自動化學發光免疫分析系統和人的甲狀腺激素試劑盒檢測大、小鼠血清甲狀腺激素水平的穩定性、可靠性以及比較不同品系大、小鼠血清甲狀腺激素水平的差異。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及血清制備 2016年11月—2017年3月，實驗動物購買于北京維通利華實驗動物技術有限公司。在溫度20～25 ℃和濕度40%～45%條件下喂養，每個飼養籠喂養3～4只鼠，光-暗周期為12 h，正常動物顆粒飼料與蒸餾水喂養10 d后進行后續實驗。本研究獲得中國醫科大學附屬第一醫院醫學科學研究倫理委員會批準。

1.1.1 昆明小鼠和SD大鼠混合血清制備 選取7～8周齡昆明小鼠60只和SD大鼠30只，戊巴比妥鈉（0.9%氯化鈉溶液溶解濃度為3%，注射劑量1.5 ml/kg），腹腔注射麻醉，小鼠用EP管摘眼球取全血，大鼠用促凝管心尖負壓取全血，室溫靜置2 h后，4 ℃冰箱過夜，次日3 800 r/min離心10 min（離心力1 051×g），分離血清。混合血清4 ℃存放，3 d內檢測。批內差檢測：SD大鼠和昆明小鼠混合血清分別進行10次重復測定，計算批內平均值、批內標準差和批內變異系數，批內變異系數=標準差/平均值×100%。日間差檢測：在相同的實驗條件下，SD大鼠和昆明小鼠混合血清每日相同時間段分別測定1次，連續測定6 d，計算批間平均值、批間標準差和批間變異系數，批間平均值即將每日測定的10個混合血清的樣本取均值后，再將連續6 d的均值取均值，批間標準差和批間變異系數計算公式如下：批間標準差批間變異系數SD為標注差，CV為變異系數。

1.1.2 不同甲狀腺激素水平的昆明小鼠和SD大鼠血清制備 選取7～8周齡昆明小鼠30只，隨機分為實驗性甲狀腺激素增多組、實驗性甲狀腺激素減少組和甲狀腺功能正常組，各10只。實驗性甲狀腺激素增多組腹腔注射左甲狀腺素（100 μg/100 g），每日同一時間注射，連續注射1周［4］。實驗性甲狀腺激素減少組采用0.025%甲巰咪唑、1%高氯酸鉀、0.3%蔗糖混合后，喂水2周［5-7］。甲狀腺功能正常組正常飲水和飼料喂養。1周后制備血清，方法同上。

選取7～8周齡SD大鼠30只，隨機分為實驗性甲狀腺激素增多組、實驗性甲狀腺激素減少組和甲狀腺功能正常組，各10只。實驗性甲狀腺激素增多組腹腔注射左甲狀腺素（20 μg/100 g），每日同一時間注射，連續注射1周［8］。實驗性甲狀腺激素減少組采用0.025%甲巰咪唑喂水2周［9］。甲狀腺功能正常組正常飲水和飼料喂養。1周后制備血清，方法同上。

1.1.3 不同品系實驗動物血清制備 選取10周齡遠交系SD大鼠、近交系BN大鼠、遠交系昆明小鼠、近交系C57BL/B6N小鼠各20只，正常飼料和飲水喂養1周后制備血清，方法同上。

1.2 實驗儀器和試劑盒 儀器：羅氏Cobas e601型全自動電化學發光免疫分析系統。羅氏電化學發光法檢測試劑盒：總三碘甲狀腺原氨酸（TT3）檢測范圍1.2～3.1 nmol/L，總甲狀腺素（TT4）檢測范圍 66～181 nmol/L，游離三碘甲狀腺原氨酸（FT3）檢測范圍3.6～6.8 pmol/L，游離甲狀腺素（FT4）檢測范圍12～22 pmol/L。

1.3 統計學方法 采用SPSS 21.0軟件進行統計學分析，以單樣本K-S檢驗計量資料的正態性，數據以（x ±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用LSD-t檢驗或Tamhane's T2檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

表1 昆明小鼠和SD大鼠混合血清的甲狀腺功能指標的批內差檢測結果（n=10）Table 1 Measurements of intra-assay differences in thyroid function indicators in mixed serum from Kunming mice and SD rats

表2 昆明小鼠和SD大鼠混合血清的甲狀腺功能指標的批間差檢測結果（n=6）Table 2 Measurements of inter-assay differences in thyroid function indicators in mixed serum from Kunming mice and SD rats

表3 不同甲狀腺激素水平的昆明小鼠、SD大鼠甲狀腺功能指標檢測結果比較（x±s）Table 3 Comparison of thyroid function indicators among different thyroid hormone levels in Kunming mice and SD rats

2 結果

2.1 甲狀腺功能指標測定結果的穩定性 昆明小鼠、SD大鼠血清甲狀腺功能指標批內變異系數分別為0.697%～1.853%、0.946%～1.253%（見表1）；昆明小鼠、SD大鼠血清甲狀腺功能指標批間變異系數分別為1.389%～2.670%、1.150%～2.834%（見表2）。

2.2 不同甲狀腺激素水平組甲狀腺功能指標檢測結果各組昆明小鼠、SD大鼠TT3、TT4、FT3、FT4水平比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）；其中實驗性甲狀腺激素增多組TT3、TT4、FT3、FT4水平高于甲狀腺功能正常組，實驗性甲狀腺激素減少組TT3、TT4、FT3、FT4水平低于甲狀腺功能正常組，差異有統計學意義（P＜0.05，見表3）。

2.3 不同品系實驗動物甲狀腺功能指標的測定 各品系實驗動物血清甲狀腺功能指標離散度均較大，多數變異系數＞10.000%（見表4），近交系實驗動物血清甲狀腺功能指標集中趨勢優于遠交系（見圖1～4）。

表4 不同品系實驗動物血清甲狀腺功能指標檢測結果Table 4 Measurements of serum thyroid function indicators in different strains of rats and mice

圖1 不同品系實驗動物血清TT3水平Figure 1 Level of serum TT3 in different strains of rats and mice

圖2 不同品系實驗動物血清TT4水平Figure 2 Level of serum TT4 in different strains of rats and mice

圖4 不同品系實驗動物血清FT4水平Figure 4 Level of serum FT4 in different strains of rats and mice

3 討論

甲狀腺激素的化學本質是氨基酸的衍生物，屬于小分子物質，不具有種屬特異性［10］。因此，理論上以抗原-抗體特異性結合為反應原理的免疫電化學發光法的人試劑盒是可以檢測大、小鼠的甲狀腺激素水平。促甲狀腺激素（TSH）與甲狀腺激素不同［11］，TSH是糖蛋白，屬大分子物質［12］，不同種屬的TSH糖蛋白的三級結構不同，具有種屬特異性，其結果受到以抗原-抗體特異性結合為反應原理的免疫電化學發光法的影響很大，因此本實驗未予探討。

本研究探討了應用羅氏全自動電化學發光免疫分析系統，以人的甲狀腺激素試劑盒檢測大、小鼠血清中甲狀腺激素水平的可行性。結果顯示：（1）羅氏全自動電化學發光免疫分析系統檢測大、小鼠甲狀腺功能指標的批內差和日間差的變異系數均＜5.000%，可見羅氏全自動電化學發光免疫分析系統檢測大、小鼠甲狀腺功能指標的穩定性好，檢測結果的可信度高［13］。（2）本研究根據目前國際上經典的實驗性甲狀腺激素增多癥和實驗性甲狀腺激素減少癥的造模方法制備了不同甲狀腺激素水平的大、小鼠血清，檢測結果發現，無論大鼠或小鼠，實驗性甲狀腺激素增多組、實驗性甲狀腺激素減少組與甲狀腺功能正常組比較，各甲狀腺功能指標的差異均有統計學意義，提示羅氏全自動電化學發光免疫分析系統的試劑盒能夠區分大、小鼠血清甲狀腺激素水平的不同。（3）本研究針對目前基礎研究中常用的近交系和遠交系的大、小鼠血清甲狀腺激素水平進行比較，結果發現無論是近交系或遠交系，大、小鼠個體間的甲狀腺功能指標檢測結果的離散度均較大，多數甲狀腺功能指標的變異系數＞10.000%。散點圖可見近交系的個體間檢測結果的集中趨勢優于遠交系，這可能與近交系和遠交系種屬的交配方法有關。近交系是連續全同胞兄妹或親子間交配20代以上所培育成的動物群體，其群體基因高度純合和穩定。遠交系是引種于某親本或同源親本的動物，讓其不以近親交配，也不與群外動物雜交而繁衍的動物種群，其目的是使得整個群體盡量防止近親交配而保持相應的遺傳變異，既保持群體的一般性又保持動物的雜合性，其遺傳組成比較接近于自然狀態下的動物群體結構［14-15］。

圖3 不同品系實驗動物血清FT3水平Figure 3 Level of serum FT3 in different strains of rats and mice

綜上所述，利用羅氏全自動電化學發光免疫分析系統和人的甲狀腺激素試劑盒檢測大、小鼠血清中的甲狀腺激素水平的穩定性好，能夠區分不同甲狀腺激素水平的大、小鼠血清甲狀腺功能指標的差異。雖然近交系大、小鼠的甲狀腺功能指標的個體間差異小于遠交系，但是兩種品系甲狀腺功能指標的測定值個體間差異仍然很大，因此在動物實驗中要保證足夠的樣本量，避免由于樣本量不足帶來的實驗誤差。本研究不足之處是由于目前國際上沒有大、小鼠的血清甲狀腺激素的質控品，因此本研究未能評估羅氏全自動電化學發光免疫分析系統對大、小鼠甲狀腺激素測定結果的準確性和精密度。

志謝：感謝中國醫科大學動物部提供動物飼養場所，以及中國醫科大學內分泌研究所對本實驗設備的支持。

作者貢獻：單忠艷、滕衛平、滕曉春進行文章的構思與設計及論文的修訂；王紅、王冉冉進行研究的實施與可行性分析、統計學處理，撰寫論文；王紅進行數據收集；王冉冉、趙得發進行數據整理；王紅、王冉冉、滕曉春進行結果的分析與解釋；滕曉春負責文章的質量控制及審校，對文章整體負責，監督管理。

本文無利益沖突。