基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)葛根治療2型糖尿病的分子機(jī)制研究*

★ 李冰濤 翟興英 涂珺 章輝 王浩臣 肖思雨 徐國良 嚴(yán)小軍 邵峰 朱衛(wèi)豐 劉榮華***（.江西中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)基礎(chǔ)理論分化發(fā)展研究中心 南昌 330004; .江西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 南昌 330004）

由于飲食結(jié)構(gòu)的調(diào)整和生活方式轉(zhuǎn)變等因素的影響，糖尿病逐漸成為威脅人類健康的重大慢性非傳染性疾病。統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示2017年全球糖尿病患者達(dá)4億，中國糖尿病患者1.14億，發(fā)病率約為總?cè)丝诘?0.9%。2型糖尿病患者占糖尿病總?cè)丝诘?0%左右。胰島素抵抗和胰島β細(xì)胞損傷導(dǎo)致外周組織肝臟、脂肪和骨骼肌對胰島素的敏感性下降是2型糖尿病的基本病理［1-2］。持續(xù)的高血糖，引起組織器官的糖毒性，誘發(fā)糖尿病并發(fā)癥，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量及生命安全。

葛根是為豆科植物野葛（Pueraria lobata（Willd.）Ohwi）的干燥根，具有退熱解肌、生津止渴等功效。其主要成分包括異黃酮類、三萜類等［3］，具有抗炎、抗氧化、降血糖、降血脂、改善胰島素抵抗等藥理活性［4］。葛根主消渴，是2型糖尿病治療的常用中藥，其作用機(jī)制可能與胰島素信號通路相關(guān)［5-6］。

本課題組認(rèn)為葛根改善胰島素抵抗、治療2型糖尿病可能是通過多靶點、多通路協(xié)同作用的結(jié)果。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是理解中藥方劑復(fù)雜化學(xué)體系與病證復(fù)雜生物系統(tǒng)的相互作用的科學(xué)方法［7］。本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究思路，檢索葛根的化學(xué)成分，結(jié)合類藥性分析技術(shù)篩選葛根的有效成分，預(yù)測其治療靶點，結(jié)合2型糖尿病的疾病網(wǎng)絡(luò)，分析葛根治療2型糖尿病的靶點，構(gòu)建葛根治療2型糖尿病的靶點交互作用網(wǎng)絡(luò)，富集葛根治療2型糖尿病的代謝通路，闡述葛根治療2型糖尿病的作用機(jī)制，為葛根治療2型糖尿病的實驗研究及產(chǎn)品開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。研究流程見圖1。

圖1 葛根治療2型糖尿病分子機(jī)制研究流程圖

1 方法

1.1 葛根化學(xué)成分及類藥性分析［8-9］化學(xué)專業(yè)數(shù)據(jù)庫由中科院上海有機(jī)化學(xué)研究所承擔(dān)建設(shè)，服務(wù)于化學(xué)化工研究和開發(fā)的綜合性信息系統(tǒng)。本研究依據(jù)化學(xué)專業(yè)數(shù)據(jù)庫的二級數(shù)據(jù)庫植物化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫檢索葛根化學(xué)成分。檢索詞為“葛”，物種名稱Pueraria lobata，學(xué)名Pueraria lobata（Willd.）Ohwi。檢索時間：2018年8月1日。為查找葛根的化學(xué)成分，刪除來源于莖、葉的化學(xué)成分，保留來源于地下根化學(xué)成分。使用PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）和ChemicalBook（http://www.chemicalbook.com/）平臺對其分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行確證，最后將化合物保存為SDF或Mol格式文件。

類藥性分析是分析化合物成為藥物的可能性，Linpinski五規(guī)則是類藥性分析的經(jīng)典方法，也是對口服藥物類藥性經(jīng)驗型規(guī)律總結(jié)。具體內(nèi)容包括分子量小于500；氫鍵給體數(shù)目小于5；氫鍵受體數(shù)目小于10；脂水分配系數(shù)小于5。符合Lipinski規(guī)則的化合物會有更好的藥代動力學(xué)性質(zhì)，在生物體內(nèi)代謝過程中會有更高的生物利用度。如果化合物違背5規(guī)則2個以上，這個化合物成藥的可能性就比較低。由于傳統(tǒng)葛根治療2型糖尿病給藥途徑是口服給藥，本研究對葛根化學(xué)成分依據(jù)Linpinski規(guī)則進(jìn)行類藥性分析。

1.2 葛根作用靶點預(yù)測［10］藥材化學(xué)成分通過與人體特定靶點相結(jié)合，通過調(diào)節(jié)靶點生物活性或轉(zhuǎn)錄水平，使藥物發(fā)揮治療疾病的作用。依據(jù)分子相似性原理，應(yīng)用化學(xué)計量學(xué)方法，預(yù)測化學(xué)成分的作用靶點，是化合物作用靶點預(yù)測有效方法。本研究Swiss target prediction在線分析軟件，預(yù)測葛根中有效化學(xué)成分的作用靶點，并將概率值大于0.5大分子作該成分的有效靶點，提取作用靶基因名稱構(gòu)建葛根化學(xué)成分靶點交互作用網(wǎng)絡(luò)。

1.3 葛根“成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 Cytoscape是一款圖形化顯示網(wǎng)絡(luò)并進(jìn)行分析和編輯的軟件，依據(jù)葛根化學(xué)成分與作用靶點的對應(yīng)關(guān)系，使用Cytoscape 3.2.1構(gòu)建葛根化學(xué)成分-作用靶點網(wǎng)絡(luò)。使用Excel構(gòu)建成分靶點對應(yīng)關(guān)系，然后將Excel文件導(dǎo)入cytoscape軟件以完成相關(guān)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，其中用“節(jié)點”（node）表示化學(xué)成分、作用靶點，用“邊”（edge）表示成分與靶點之間關(guān)系。

1.4 葛根治療2型糖尿病蛋白質(zhì)交互作用網(wǎng)絡(luò)（PPI） 糖尿病是一種慢性疾病，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及多個蛋白功能改變。本研究應(yīng)用在線文本挖掘服務(wù)器CooLGeN（http：//ci.smu.edu.cn/CooLGeN/）獲取2糖尿病疾病相關(guān)基因。具體設(shè)置為以type 2 diabetes mellitus為關(guān)鍵詞，雜志影響因子選擇5～40，發(fā)表年限為1980～2018年，檢索數(shù)據(jù)庫為MEDLINE，物種設(shè)置為人。檢索有已報道2型糖尿病相關(guān)蛋白，提取80%以上疾病基因，作為疾病靶基因。

通過對于葛根治療靶點及2型糖尿病疾病靶點交叉分析，獲取葛根治療2型糖尿病的靶點，將葛根對2型糖尿病的治療靶點導(dǎo)入GeneMANIA蛋白質(zhì)交互作用網(wǎng)絡(luò)分析網(wǎng)站，構(gòu)建葛根治療2型糖尿病蛋白質(zhì)交互作用網(wǎng)絡(luò)。

1.5 葛根治療2型糖尿病通路（pathway）富集分析 采用ClueGO分析插件，對上述葛根治療2型糖尿病的作用網(wǎng)絡(luò)涉及作用靶點，進(jìn)行生物通路進(jìn)行富集分析。方法是將葛根治療2型糖尿病（protein-protein interaction network）PPI網(wǎng)絡(luò)節(jié)點（基因名稱）導(dǎo)入ClueGo插件，限定物種為人，經(jīng)上述數(shù)據(jù)庫檢索和轉(zhuǎn)化操作，設(shè)定閾值P＜0.05，evidience設(shè)定為all，進(jìn)行通路（pathway）富集分析。

2 結(jié)果

2.1 葛根化學(xué)成分及類藥性分析 通過檢索化學(xué)專業(yè)數(shù)據(jù)庫，本研究共檢測到葛化學(xué)成分157種，其中無機(jī)物及金屬離子6種，22個化學(xué)成分來源于葛根花、葉，10個化學(xué)成分結(jié)構(gòu)信息尚在更新中。對其余119個化學(xué)成分分別使用Pubmed和Chemicalbook進(jìn)行結(jié)構(gòu)確認(rèn)，另有19個化學(xué)成分結(jié)構(gòu)信息無法確認(rèn)。去除葛中金屬離子、結(jié)構(gòu)無法確認(rèn)化合物及來源于花葉中的化學(xué)成分，本研究獲得葛根化學(xué)成分100個。

計算葛根中化學(xué)成分的Linpinski參數(shù)，其中6個化學(xué)成分違背Linpinski規(guī)則，94個成分符合Linpinski規(guī)則，具有較好的類藥性。將這些化學(xué)成分編號及CAS號整理，具體見表1。

表1 葛根類藥性化學(xué)成分表

2.2 葛根化學(xué)成分-靶點網(wǎng)絡(luò) 使用Swiss target prediction在線軟件化學(xué)成分靶點預(yù)測軟件，選擇靶點概率大于0.5有效靶點。Excel建立化學(xué)成分-作用靶點的對應(yīng)關(guān)系，Cytoscape構(gòu)建成分-靶點的相互作用網(wǎng)絡(luò)（圖2）。由于94個類藥性成分中24個成分預(yù)測靶點概率均小于0.5，視此成分無有效靶點，構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)是不考慮此成分。網(wǎng)絡(luò)基于葛根中70個化學(xué)成分，作用于180靶點。葛根成分-靶點網(wǎng)絡(luò)作用圖反映了葛根“多成分，多靶點”作用的特點，也提示葛根治療2型糖尿病作用機(jī)制可能是與葛根多靶點作用相關(guān)。

圖2 葛根類藥性成分與靶點網(wǎng)絡(luò)

2.3 葛根治療2型糖尿病治療靶點蛋白質(zhì)交互作用網(wǎng)絡(luò) 通過對CoolGEN數(shù)據(jù)庫檢索，研究共獲得2型糖尿病疾病相關(guān)基因297個，通過與葛根180個治療靶點的交互作用分析，發(fā)現(xiàn)13個疾病與葛根共有靶點（圖3）。

圖3 葛根作用靶點及2型糖尿病疾病靶點的交叉分析

機(jī)體的內(nèi)在調(diào)控往往不是單一的信號通路支配的，而是復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。不同的信號通路和靶點之間會存在一定程度的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，藥物的治療作用除表現(xiàn)為成分靶點的直接結(jié)合外，更多見于直接調(diào)控靶點與間接調(diào)控其他靶點相結(jié)合的調(diào)控方式。而蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系數(shù)據(jù)為尋找靶點的直接、間接調(diào)控作用關(guān)系提供了可能。為探索葛根治療2型糖尿病的作用機(jī)制，研究將葛根治療2型糖尿病的作用靶點13個靶點，以基因名稱導(dǎo)入GeneMANIA數(shù)據(jù)庫，構(gòu)建起蛋白質(zhì)交互作用網(wǎng)絡(luò)（圖4），該網(wǎng)絡(luò)共有33個蛋白。

圖4 葛根治療2型糖尿病靶點蛋白質(zhì)交互作用圖（圓圈大小：節(jié)點度；線條粗細(xì)：交互作用可能性）

2.4 葛根治療2型糖尿病靶點的通路富集分析 依據(jù)葛根治療2型糖尿病靶點交互作用網(wǎng)絡(luò)，提取相互作用靶點以基因名稱導(dǎo)入ClueGo，對葛根治療2型糖尿病靶點進(jìn)行通路富集分析。富集結(jié)果見圖5。通過對生物通路的富集分析，發(fā)現(xiàn)葛根治療2型糖尿病通路包括脂肪攝取及消化，PPAR信號通路，甘油三酯催化通路及甘油三酯代謝通路，游離脂肪酸通路及長鏈脂肪酸通路，調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞脂化，前列腺素合成及調(diào)節(jié)通路，硒微量元素網(wǎng)絡(luò)通路，色氨酸代謝通路，AGE/RAGE通路等14條代謝通路。

圖5 葛根治療2型糖尿病相關(guān)通路網(wǎng)絡(luò)

3 討論

2型糖尿病是是一種血糖升高為主要特征的代謝性疾病，其臨床表現(xiàn)主要是血糖升高、脂代謝紊亂。胰島素抵抗是指主要的病理因素，目前認(rèn)為胰島素抵抗的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，其中脂毒性學(xué)說、微量元素缺乏學(xué)說、慢性炎癥學(xué)說是糖尿病重要發(fā)病機(jī)制學(xué)說。葛根主消渴，2型糖尿病屬消渴的范疇，研究表明葛根及主要成分葛根素具有降血糖、降血脂，治療2型糖尿病。探索葛根治療2型糖尿病的作用機(jī)制對于葛根的臨床應(yīng)用及產(chǎn)品開發(fā)具有重要的意義。

本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，探索葛根治療2型糖尿病的機(jī)制。發(fā)現(xiàn)94個具有較好的吸收特征葛根化學(xué)成分，這些化學(xué)成分可能是葛根藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)。依據(jù)分子相似性原理預(yù)測化學(xué)成分作用靶點，葛根化學(xué)成分主要作用180個靶點，其中13個靶點為藥材與疾病共有靶點，通過蛋白質(zhì)交互作用分析，構(gòu)建基于33個基因交互作用靶點網(wǎng)絡(luò)。對葛根治療2型糖尿病的蛋白質(zhì)交互作用網(wǎng)絡(luò)上蛋白進(jìn)行通路富集分析，葛根治療2型糖尿病的通路包括脂肪攝取及消化，PPAR信號通路，甘油三酯催化通路及甘油三酯代謝通路，游離脂肪酸聯(lián)合長鏈脂肪酸通路，調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞細(xì)胞中脂質(zhì)分解等14條通路。

葛根治療2型糖尿病的主要機(jī)制可能與葛根對脂質(zhì)的影響有關(guān)。葛根影響脂肪消化和吸收，從而減少外源性脂肪進(jìn)入體內(nèi)；其次影響甘油三酯的催化和代謝，降低體內(nèi)甘油三酯的水平；再次影響脂肪酸結(jié)合蛋白與長鏈脂肪酸的結(jié)合，從而影響循環(huán)系統(tǒng)脂肪酸含量。目前研究證實具有改善2型糖尿病脂代謝紊亂，降低甘油三酯和游離脂肪酸水平［11］。PPAR信號通路可能在葛根改善糖尿病患者脂肪水平過程發(fā)揮重要作用。PPAR是過氧化物酶體增殖劑激活受體，主要包括α，β/δ，γ三種亞型。PPARα主要表達(dá)于脂肪酸分解代謝速度較快的棕色脂肪細(xì)胞中，其次表達(dá)于肝、腎、心臟、骨骼肌細(xì)胞中，PPARα可以通過多種通路調(diào)節(jié)膽固醇和游離脂肪酸［12］，PPARβ的表達(dá)較為廣泛，在脂肪酸的分解代謝、能量代謝及膽固醇逆向轉(zhuǎn)運中起一定作用。PPARγ其次表達(dá)于腎、脾、肝臟、小腸、骨骼肌和巨噬細(xì)胞中，已被證明對調(diào)節(jié)糖脂代謝有著重要的作用［13］。葛根及葛根素可以調(diào)節(jié)是實驗動物和脂肪細(xì)胞中PPARγ的表達(dá)，改善胰島素抵抗模式生物的糖脂代謝紊亂［14-15］。

上述通路富集結(jié)果還顯示，網(wǎng)絡(luò)集群中還覆蓋了硒微量元素網(wǎng)絡(luò)，前列腺素合成及調(diào)節(jié)通路、脂肪組織中脂質(zhì)水解，色氨酸代謝，AGEs/RAGEs通路。因此除了影響糖尿病患者脂質(zhì)代謝，改善脂代謝紊亂治療糖尿病病外，葛根還具有影響體內(nèi)多種通路發(fā)揮抗糖尿病的作用。

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析藥物與疾病相互網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，有效地揭示葛根治療2型糖尿病的作用機(jī)制，為葛根治療型糖尿病的實驗設(shè)計的優(yōu)化及葛根產(chǎn)品開發(fā)提供了實驗依據(jù)。