E6/E7 mRNA檢測在高危型人乳頭瘤病毒DNA陽性且細胞學輕度異常患者隨訪中的作用

王蘭英，施姚，張生枝，徐瑛，何燕，朱雪瓊

（1.溫州醫科大學附屬第二醫院 婦產科，浙江 溫州 325027；2.余姚市人民醫院 婦產科，浙江 寧波315400）

宮頸癌是全球婦女中第三常見的惡性腫瘤[1]，宮頸癌前病變的篩查仍是預防宮頸癌的主要手段。無明確診斷意義的不典型鱗狀細胞（atypical squamous cell of undetermined significance，ASCUS）和低度鱗狀上皮內病變（low-grade squamous intraepithelial lesions，LSIL）在宮頸細胞學篩查異常結果中是最常見的。ASCUS及LSIL約占宮頸脫落細胞學的10%～20%，而ASCUS和LSIL的CINII+病變率約為15%[2]，因此合理處理ASCUS及LSIL一直是臨床醫師面臨的實際問題之一。研究表明，E6E7 mRNA檢測的敏感性和HPV DNA相當，而特異性更好[3-4]，因此E6/E7 mRNA成為篩選HPV DNA陽性而細胞學輕度異常（ASCUS及LSIL）患者的生物標志物[5]。本研究主要對HPV DNA陽性，細胞學輕度異常（ASCUS或LSIL）且陰道鏡下活檢病理學結果為CINII-的患者行E6/E7 mRNA測定，并分析隨訪2年后CINII+的發生率，探討對HPV DNA陽性且細胞學輕度異常（ASCUS或LSIL）、陰道鏡下活檢病理學結果為CINII-患者的合理處理方法。

1 對象和方法

1.1 對象 收集余姚市人民醫院門診2015年1月至2015年12月薄層液基細胞學檢測（thinprep cytologic test，TCT）結果為ASCUS或LSIL、HPV-DNA高危陽性的女性患者332例，年齡30～65歲。排除妊娠、既往因宮頸病變行手術治療、盆腔放射史、子宮切除病史者。均行HPV E6/E7 mRNA檢查，均在簽署知情同意書后行陰道鏡下活檢及病理學檢查。

1.2 方法

1.2.1 TCT方法：TCT毛刷取材，取材前應禁止性生活及陰道沖洗3 d，取材位置在宮頸管及鱗柱上皮交界處，向同一方向旋轉5圈，將細胞刷洗在TCT專用取樣瓶中，經TCT專用制片機制成薄層涂片，樣本經巴氏染色后鏡檢。

1.2.2 HPV DNA檢測：暴露宮頸后，采用HPV專用毛刷，伸入宮頸口，順時針旋轉3～5圈，將刷頭折斷保存在HPV專用取樣瓶中。采用PCR反向點雜交技術，按照試劑盒說明進行操作。HPV毛刷、細胞保存液、試劑盒及儀器均購自深圳亞能生物技術有限公司，試劑批號為：201507211。

1.2.3 HPV E6/E7 mRNA檢測：利用TCT剩余標本檢測HPV E6/E7 mRNA。試劑盒和儀器均購自鄭州中美合資科蒂亞生物技術有限公司，試劑批號為：1501a1。由實驗人員記錄標本編號，事先對標本診斷不知情，嚴格按照試劑盒說明進行操作。Quanti-Virus-tm冷光儀檢測標本，檢測結果為光子數，經計算機軟件轉換為拷貝數。

1.2.4 組織病理學檢查：由護士登記患者資料后，婦產科陰道鏡專科醫師對患者行陰道鏡下檢查，涂碘液后，對可疑病灶進行定位活檢。標本制片由病理科醫師完成。診斷分為：正常或炎癥，宮頸上皮內瘤變，浸潤癌。

1.2.5 隨訪：病理檢查結果為CINII-的患者定為隨訪對象，隨訪間隔為6個月，隨訪總時間為24個月。隨訪方式為TCT檢查、宮頸HPV檢測、陰道鏡下檢查及宮頸活檢。隨訪期間高危型HPV陽性病例在自愿的原則下均接受正規療程的抗病毒治療，治療藥物均為同一種藥物。隨訪終點為：①陰道鏡下病理活檢為CINII+；②TCT及HPV檢查均轉為陰性；③到達隨訪時間2年。隨訪期間出現妊娠或因其他原因行子宮切除術的視為無效。

1.3 統計學處理方法 采用SPSS19.0軟件進行統計學分析。率的比較采用χ2檢驗，隨訪資料采用Kaplan-Meier法分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

332例高危HPV DNA陽性患者中，ASCUS共154例（占46.4%），LSIL共178例（占53.56%），其中E6/E7 mRNA陽性204例（占61.4%），陰性128（占38.6%），初次陰道鏡下活檢病理分布情況見表1。E6/E7 mRNA陽性組CINII+發生率為42/204（20.6%），陰性組為13/128（10.2%），差異有統計學意義（χ2=5.46，P=0.02）。

表1 332例患者初次陰道鏡檢查結果（例）

陰道鏡下檢查無可疑病灶及病理結果為炎性病變及CINI的患者共277例進入隨訪，隨訪期間有17例失訪，2例妊娠，1例行子宮切除術，最終257例（E6/E7 mRNA陽性組158例，陰性組99例）患者完成隨訪（24個月），E6/E7 mRNA陽性組共發生CINII+ 33例（占20.89%），陰性組發生CINII+ 7例（占7.07%），累積疾病進展率的差異有統計學意義（P=0.002），見圖1。

圖1 全部患者E6/E7 mRNA陽性組和陰性組隨訪24個月的疾病進展情況

非絕經患者187例，E6/E7 mRNA陽性116例，陰性71例，陽性組共發生CINII+ 20例（占17.24%），陰性組共發生CINII+ 5例（占7.04%），累積疾病進展率的差異有統計學意義（P=0.013），見圖2。

圖2 非絕經患者E6/E7 mRNA陽性組和陰性組隨訪24個月的疾病進展情況

絕經患者70例，其中E6/E7 mRNA陽性42例，陰性28例，陽性組共發生CINII+ 13例（占30.95%），陰性組共發生CINII+ 2例（占7.14%），累積疾病進展率的差異有統計學意義（P=0.045），見圖3。

E6/E7 mRNA陰性組隨訪6個月時無CINII+病例出現，陰性預測值為100%，12個月時出現CINII+病例1例，隨訪結束共出現7例，2年陰性預測值為93.2%。E6/E7 mRNA陽性組隨訪6個月時有3例CINII+病例發生，隨訪結束共有33例，陽性預測值為22.4%；E6/E7 mRNA檢測預測CINII+的特異性是42.4%。見表2。

圖3 絕經患者E6/E7 mRNA陽性組和陰性組隨訪24個月的疾病進展情況

3 討論

高危型HPV DNA持續感染是絕大多數癌前病變和宮頸癌發生的主要原因。HPV相關的生物標志物E6/E7 mRNA是致癌基因E6/E7表達的直接產物，是導致宮頸病變開始和進展的必要條件，更能體現HPV致癌基因的活動程度并預測病情[6]。本研究經過2年的隨訪發現細胞學輕度異常（ASCUS或LSIL）的高危型HPV DNA陽性患者中，E6/E7 mRNA陽性者發生CINII+風險顯著高于陰性者，HPV E6/E7 mRNA預測CINII+發生的特異性是42.4%，陽性預測值為22.4%，陰性預測值為93.2%。

絕經后由于鱗柱交界上移，TCT及陰道鏡檢查準確率下降[7]，對這部分人群進行合理的癌前篩查，能有效降低宮頸癌的發病率。ASCIUTTO等[8]報道，在絕經人群中，E6/E7 mRNA預測CINII+的特異性達到60.2%，可作為分流ASCUS及LSIL的生物標志物。本研究也表明，在絕經人群中，E6/E7 mRNA陽性患者疾病的進展風險高于陰性組。在絕經人群E6/E7 mRNA陰性組隨訪18個月始出現1例CINII+，故對于細胞學輕度異常（ASCUS或LSIL）的高危HPV DNA陽性的絕經患者，若E6/E7 mRNA陰性，可延長隨訪間隔時間，避免頻繁的陰道鏡檢查。

表2 E6/E7 mRNA陽性組和陰性組隨訪24個月CINII+的發生情況

在過去的50多年，大多數國家采用宮頸細胞學為全部適齡女性篩查方案，有效降低了宮頸癌的發病率[9]。一項薈萃分析表明宮頸ASCUS和LSIL的高危型HPV DNA的感染率分別達到了43%和76%，而大約91%的HPV陽性患者能夠在半年至2年后轉陰，71%的患者細胞學轉至正常[10]。HPV DNA檢查較低的特異性增加了不必要的陰道鏡檢查及醫療資源的浪費。而本研究中HPV E6/E7 mRNA預測CINII+的特異性是42.4%，和PERSSON等[11]研究HPV E6/E7 mRNA在預測CINII+的特異性為50%相似，而明顯高于JOHANSSON等[12]的5.4%～12.7%。這可能與基線HPV E6/E7mRNA陽性率有關，JOHANSSON等的研究中基線HPV E6/E7 mRNA陽性率為92.1%，而本研究為61.4%。

隨訪中發現，E6/E7 mRNA陽性患者隨訪6個月后有3例CINII+病例發現，而這3例均為HPV16/18陽性患者，預示著細胞學輕度異常（ASCUS或LSIL）的高危HPV DNA陽性患者，當E6/E7 mRNA和HPV16/18同時陽性時，應縮短隨訪時間，加大陰道鏡檢查的頻率，減少漏診率。而針對E6/E7 mRNA陰性患者，隨訪6個月時并無CINII+病例發生，隨訪12個月出現1例，表明對于細胞學輕度異常（ASCUS或LSIL）的高危HPV DNA陽性患者，即使E6/E7 mRNA陰性也應隨訪，但可延長隨訪間隔時間，減少陰道鏡檢查次數，這與PERSSON等[11]觀點基本一致。需要指出的是E6/E7 mRNA陰性的患者，隨訪24個月并無CINIII+及宮頸癌的發生，對CINIII+的陰性預測值達到100%，與JOHANSSON等[12]的結論是一致的。

隨著隨訪時間的延長，E6/E7 mRNA陽性患者發生CINII+的累積風險是增加的，24個月隨訪結束時E6/E7 mRNA陽性患者發生CINII+的病例數明顯多于前3次隨訪的病例數。

總之，對高危型HPV DNA陽性、TCT為ASCUS或LSIL的患者隨訪中，無論其是否絕經，HPV E6/E7 mRNA檢測可作為分流此類患者的有效生物標志物。當E6/E7 mRNA陽性，尤其合并HPV16/18陽性時，應縮短隨訪間隔時間。隨隨訪時間延長，若兩者均持續陽性，應加大陰道鏡檢查的頻率，以降低漏診率。E6/E7 mRNA陰性患者也應隨訪，但可延長隨訪間隔時間，以減少陰道鏡檢查次數。但由于病例數及隨訪時間仍有限，更確切的結論尚待進一步的隨訪觀察。